苔类植物黄酮类化合物生物合成途径系统解析及进化研究

The bryophtyes represent a transitional form between aquatic plants and true land plants, so have a key evolutionary status. The liverworts, a class of bryophtyes, are the most primitive plants known to be able to synthesize flavonoids, in particular flavone, 5-deoxyflavone and flavone glycoside. The synthesis of flavonoids in liverworts was investigated over recent years by the applicant in collaboration with co-workers. These researches demonstrated that type II chalcone isomerase (CHI) exists in liverworts, whereas it was conventionally believed to be specific in species belonging to the Fabaceae (legumes). The liverworts were shown to harbor chalcone reductase (CHR) and flavone synthase I (FNSI). The latter possessed both desaturase and hydroxylase activity and produced the substrate for UDP-dependent glycosyltransferase (UGT) to produce flavone glycoside. However, the catalytic mechanism of FNSI and the biological function of CHR and UGT in liverworts remains elusive. Here the applicants propose to characterize the role of CHR, in conjunction with chalcone synthase (CHS) and CHI, in the synthesis of flavone and 5-deoxyflavone. The catalytic mechanism of FNSI will be elucidated by means of protein crystallography, domain swapping and site-directed mutagenesis. The evolutionary relationship between liverwort FNSI, the Apiaceae FNSI and flavonone 3-hydroxylase (F3H) enzymes will be clarified. UGT function will be revealed via in vitro enzyme assay and in vivo substrate feeding experiments in either E. coli or yeast cells expressing liverwort UGT and FNSI. The contribution of FNSI and UGT to the in vivo synthesis of flavone glycoside will be elucidated by constructing the appropriate transgenic plants. The expected outcomes of the research will shed light on the function, catalytic mechanism, interaction and evolutionary relationships of the key liverwort enzymes in the flavonoid biosynthesis pathway and lay a basis for the elucidation of the origin and evolution of flavonoids.

苔藓是植物由水生向陆生过渡的重要类群，进化地位特殊，是最早合成黄酮的植物，含有黄酮、5-脱氧黄酮及其苷类(O-苷和C-苷)。前期研究证明苔类植物含有Ⅱ型查尔酮异构酶(CHI)，这是首次在非豆科植物中发现Ⅱ型CHI，并提示查尔酮还原酶(CHR)的存在；首次证明苔类植物I型黄酮合成酶(FNSI)具有脱氢和羟基化双功能，其产物可被黄酮糖基转移酶(UGT)催化生成黄酮苷类。FNSI催化机制、CHR和UGT功能尚未研究，本项目拟研究CHR与查尔酮合成酶(CHS)和CHI共同在黄酮及5-脱氧黄酮合成中的作用与进化地位；通过蛋白晶体结构解析阐明FNSI催化机制，分析其进化关系；通过重组蛋白体外酶活、将FNSI和UGT共同构建入大肠杆菌和酵母并饲喂前体等方法鉴定UGT功能；通过转化植物阐明FNSI和UGT在黄酮C-苷和O-苷合成中的作用，系统解析苔类植物黄酮合成途径，为阐明黄酮生物合成起源和演化奠定基础。

该项目系统研究了苔类植物类黄酮生物合成关键酶功能及演化机制。通过对苔类植物和江南卷柏查尔酮异构酶CHI家族基因体外和体内功能的研究证明早期陆生植物中不含有I型CHI，而是含有II型CHI，同时含有III型和IV型CHI，III型CHI具有脂肪酸结合功能，这是首次证明非维管植物中含有真正有功能的CHI，而且证明II型CHI比I型CHI出现早，更新了前人关于两种类型CHI进化关系的认识。随后我们通过研究22种不同进化地位蕨类植物CHI基因的体内外功能，证明随着植物进化，在蕨类植物中开始出现I型CHI。而且证明蕨类植物IV型CHI(CHIL)与CHS和CHI相互作用，通过促进CHS催化产生的聚酮中间体的正确环化而抑制副产物CTAL的产生，增强黄酮类化合物的生成。从苔类植物中克隆鉴定了黄酮合酶I(FNS I)的功能，通过研究不同进化地位植物中相关基因的功能，证明FNS I比F3H出现早，通过关键氨基酸的定点突变和酶活验证，推测从苔藓到被子植物黄酮到黄酮醇和花色素的化学进化机制是由FNS I经FNS I/F2H和FNS I/F3H到F3H的功能演化。研究发现参与苔类植物联苄合成的羧基茋类合酶STCS1属于III型聚酮合酶，与查尔酮合酶CHS同源，解析了STCS1的蛋白晶体结构(PDB: 5YPT)，并阐明了从STCS1到CHS的功能转变。克隆鉴定了华南毛蕨CHS功能，并解析了其晶体结构(PDB:7VEY)以及与产物柚皮素的共晶(PDB: 7VEZ)，通过关键氨基酸定点突变阐明了其催化活性相关的位点。鉴定了苔类植物黄酮糖基转移酶的功能，并将其和上游基因共同构建入原核表达载体，探讨了其在酶催化和半合成黄酮糖苷类化合物中的应用。该项目研究了苔类植物黄酮类化合物生物合成关键酶功能，同时研究了其与不同进化地位植物中同源基因的功能演化关系，对研究植物次生代谢过程的进化机制具有重要意义。