苔类植物双联苄类化合物生物合成关键酶基因功能鉴定与代谢工程研究

苔类植物含有一类特有的具有较强抗真菌及抗肿瘤活性的双联苄类化合物。同位素追踪实验证明该类化合物来自苯丙类生物合成途径，羧基茋类合成酶和参与酚偶联反应的细胞色素P450是该途径的关键酶，但是迄今为止，尚没有该途径上的关键酶基因被克隆和鉴定，已成为通过代谢工程提高该类化合物含量的瓶颈。前期工作中，以富含双联苄类化合物的钝鳞紫背苔为材料，建立了cDNA文库并进行EST测序，根据序列功能注释筛选出了参与双联苄生物合成的羧基茋类合成酶基因和4个P450基因。本项目拟将这些侯选基因通过大肠杆菌和酵母的异源表达及体外酶活分析，鉴定参与双联苄生物合成的关键酶基因，研究其酶促反应特点和底物选择性，阐明双联苄类化合物的生物合成途径，并将目标基因转入地钱和拟南芥，分析过表达引起的双联苄和其它苯丙类化合物含量的变化，研究关键酶在维管植物和非维管植物中的催化机制，为进一步利用代谢工程大量合成该类化合物奠定基础。

双联苄类化合物是苔类植物所特有的一类天然产物，其生物合成途径起始于苯丙氨酸，经苯丙氨酸裂解酶(L-phenylalanine ammonia-lyase, PAL)，4-羟基肉桂酰辅酶A连接酶(p-coumarate CoA ligase, 4CL)，羧酸茋类合成酶(stilbenecarboxylate synthase, STCS)，细胞色素P450等催化生成。双联苄类化合物和黄酮类化合物来源于同一生物合成途径，共用上游基因。该研究通过构建EST文库，转录组测序等方法获得了编码给途径关健酶的基因信息，从钝鳞紫背苔和粗裂地钱中克隆了相关基因序列，对基因分别进行相关序列比对和进化树分析。并将基因构建入原核或真核表达载体，进行蛋白表达和酶活测定，成功鉴定了PAL, 4CL, STCS和P450基因的功能。并通过代谢工程的方法将羧酸茋类合成酶和P450转入钝鳞紫背苔愈伤组织，提高了联苄类化合物的含量。另外还鉴定了查尔酮合成酶(chalcone synthase)，查尔酮异构酶(chalcone isomerase)，黄酮合成酶(flavone synthase)以及黄酮氧甲基转移酶(flavonoid O-methyltransferase)的功能，这些基因都是首次从苔类植物中克隆鉴定。通过本项目的研究，成功鉴定了苔类植物联苄和黄酮类化合物生物合成关健酶，为通过代谢工程生产苔类植物次生代谢产物奠定了基础。