机体响应布鲁氏菌强弱毒株感染白细胞差异表达基因研究

布鲁氏菌病(布病）是主要危害人畜生殖系统的人兽共患传染病，患病动物是主要传染源。近几年疫情急骤回升，主要原因是布病综合防控措施不利。国家缺乏扑杀补偿政策，加之没有正确区分疫苗接种与自然感染动物的诊断方法，畜主不愿意扑杀阳性诊断动物，使得疫源动物长期存在，动物病健分群无法实施，计划免疫难以实现。国内还没有关于布鲁氏菌致病分子机制的研究报道。本项目利用抑制性差减杂交(SSH)技术，分别构建布鲁氏菌强毒株和弱毒株感染绵羊白细胞正向和反向SSH cDNA文库，筛选不同毒力株布鲁氏菌感染机体后白细胞差异表达新基因，通过研究基因差异表达模式、生物学特性及其主要效应白细胞等，揭示宿主免疫细胞响应布鲁氏菌感染、细胞内寄生与繁殖的差异表达功能基因及其表达规律，为寻求有效区分疫苗接种和野毒感染动物的生物标示物，研发鉴别诊断新方法，提供一系列有意义的靶标分子，为进一步阐明布鲁氏菌致病的宿主反应分子机制奠定基础。

布鲁氏菌病(布病)是危害严重的人兽共患传染病,人与人之间几乎不传染，患病动物是主要传染源。近几年疫情急骤回升,加强布鲁氏菌致病分子机制的研究具有重要的意义。本项目利用抑制性差减杂交(SSH)技术,分别构建雄性绵羊响应布鲁氏菌羊种强毒株和弱毒株S2感染白细胞层SSH cDNA文库,总计测序5000个克隆子，通过序列分析初步选定30个目标基因进一步研究，最终获得10个重点目标基因（CDC42、PDCD10、CD53、CD96、Poxdn6、VNN2、IL1b、IL1RN、LYZ、ThymB4X）全长cDNA序列，利用pET-28a或pET-30a原核表达载体，构建了8个基因（CDC42、PDCD10、CD53、CD96、Poxdn6、VNN2、IL1b、IL1RN）的原核系统表达载体，纯化获得5个基因（CDC42、PDCD10、CD53、CD96、Poxdn6）的人工表达重组蛋白，并制备了它们的特异性结合的单克隆抗体，定向分析了Poxdn6、CDC42、PDCD10等3个重组蛋白的生物学活性。探讨了10个基因（CDC42、PDCD10、CD53、CD96、LYZ、Poxdn6、VNN2、Sulred1、CD52、CD16A）在强毒株或弱毒株感染初期、中期、后期的基因差异表达模式。分析了4个基因（PDCD10、CDC42、CD53、CD96）的主要表达白细胞类型，并利用2个基因及其表达蛋白（CDC42、Poxdn6）初步建立有望应用于区别诊断布鲁氏菌病野毒感染和疫苗接种的ELISA检测方法。本项目利用SSH、基因克隆表达、单抗制备、原位杂交、荧光定量PCR等一系列分子生物研究手段，筛选布鲁氏菌不同毒力株感染羊白细胞差异表达基因，通过研究基因差异表达模式、生物学特性及其主要效应白细胞等，为寻求有效区分疫苗接种和野毒感染动物的生物标示分子，研发鉴别诊断新方法，提供一系列有意义的靶标分子。