宿主细胞CCCH型锌指抗病毒蛋白与禽白血病病毒互作机制

CCCH-type zinc finger antiviral protein (ZAP) is a new discovery protein which is a important defense protein of anti-virus systems in host cells. It belonging to a super-protein family, which can specific degradation of viral mRNA in cells. Our previous study found that CCCH-type ZAP that exist in normal and infected tissues can inhibit the replication of avian leukosis virus (ALV).For elucidation the interaction mechanism between CCCH-type ZAP and exogenous avian leukosis virus (ALV), we intended to construct chicken recombinant CCCH type of ZAP (cZAP) vectors, eukaryotic expression of cZAP, and take wild-type and pseudotype ALV as the target. Base on the gene sequence, motif, structural characteristics of cZAP and ALV, we study the interaction pattern and mechanism between cZAP and mRNA of ALV. The results would make clear: the space structural characteristics and net contribution of the cZAP, the defance pattern of cZAP in host cells, the key part of ALV replication blocked by cZAP,the key interation sites and motifs between cZAP and ALV, the pathway of co-factors involved in interaction between cZAP and mRNA of ALV.Eventually, we shed light on the interaction mechanism between avian CCCH-type ZAP and exogenous mRNA of ALV, as well as in-depth study of host defense protein system, and as a scientific basis for the virus-host interactions and host antiviral protein drugs study.

CCCH型锌指抗病毒蛋白（cZAP）是近年新发现的、可特异降解病毒mRNA的真核细胞抗病毒防御系统中的超蛋白家族成员。目前,在家禽中还未见相关研究报道。我们在前期研究中发现，鸡正常及病毒感染组织中存在含量不同的可抑制禽白血病病毒（ALV）复制的cZAP。为解析cZAP与禽外源ALV互作机制，本研究拟通过cZAP重组载体转染和cZAP真核表达两种途径，以野型和假病毒ALV为靶标，从cZAP及ALV的基序和空间结构特点入手，体内外研究cZAP重组载体及cZAP蛋白与ALV的互作，解析cZAP的基本结构特征及网络分布；cZAP阻断ALV在细胞内复制的关键环节；cZAP与ALV互作的线性及空间基序；影响cZAP降解ALV的主要因素。最终阐明cZAP与ALV互作机制、cZAP应对ALV突变逃避机制，确定控制ALV感染的有效方法。本研究为宿主防御体系与病毒互作及新型抗病毒药物的研究奠定了科学基础。

鸡锌指抗病毒蛋白（chZAP）是宿主体内的一种天然防御因子，进化上高度保守。前期有研究表明哺乳动物ZAP对相关病毒复制具有很好的抑制活性，但是对于禽类ZAP的抗病毒研究未见报道。由于J亚群禽白血病病毒（ALV-J）具有超突变性，至今未研制出效果明显的疫苗或药物，因此本研究以ALV-J为对象来探究chZAP的抗病毒活性以及所参与的天然免疫信号转导通路。本研究成功克隆chZAP基因，对其进行遗传进化分析，构建蛋白表达载体表达chZAP蛋白并制备多克隆抗体。结果：chZAP基因在不同物种之间存在较大差异，但是主要功能区CCCH型锌指结构域在不同物种之间高度保守，这也为chZAP抗病毒活性的研究提供了支撑。为进一步探究chZAP对ALV-J病毒复制的抑制活性，本研究构建了chZAP慢病毒载体，实现chZAP在体内外的过表达，通过对chZAP和ALV-J病毒各项指标检测，分析chZAP的抗病毒活性。此外，本研究通过设计并合成针对chZAP基因的siRNA，实现对内源性chZAP的基因沉默，从反面角度进一步验证chZAP对ALV-J病毒复制的抑制作用。研究表明，过表达条件下chZAP可以显著抑制ALV-J在DF-1细胞中的复制，并且chZAP在ALV-J感染后发生细胞质积累现象，chZAP与ALV-J共定位于胞浆中，表明chZAP属于可诱导蛋白并且在细胞质中发挥抗病毒作用。对chZAP基因沉默后，ALV-J病毒在DF-1细胞中复制水平显著升高，这就从反面的角度证明chZAP对ALV-J病毒复制具有显著的抑制效果。此外，体内过表达chZAP可以有效抑制ALV-J在机体内的复制，大大降低病毒侵袭对机体带来的损伤，并且chZAP倾向于在免疫器官中高水平表达，这对于下一步研究chZAP在机体内参与的天然免疫机制具有重要参考意义。除此之外，本研究以ALV-J病毒感染DF-1细胞，然后在细胞培养上清中加入表达并纯化后的chZAP蛋白，收集细胞检测ALV-J病毒各项指标。结果：表达并纯化后的chZAP可以作为有效抑制ALV-J在细胞中复制的制剂。这也为天然免疫药物的开发提供思路，在以后的工作中，需要对chZAP抑制病毒复制的机制进行深入探究，以期更好地利用体内相关的天然免疫机制解决生产实践中的问题。