选择压作用下禽白血病病毒J亚群囊膜突变规律的研究

选择压是禽白血病病毒J亚群(ALV-J)囊膜突变的关键诱因,囊膜突变会直接导致其宿主范围、感染力及致瘤性的改变。为明确ALV-J在选择压作用下囊膜突变规律，解析ALV－J在我国的流行特点，本研究以衍生于病毒的抑制物、不同禽品系细胞及相应不同品系鸡这三类影响囊膜突变的主要因素作为选择压来源，模拟自然条件下免疫压力及种间遗传压力促进病毒突变模式，在受体的诱导下，以抑制物促进病毒发生突变，经过稳定传代，测序分析病毒发生突变位点,明确其突变规律；以此为基础筛选囊膜内保守序列，经RNA干扰方法确证其功能后，制备多克隆抗体，体内外检测其抗原型株及突变株病毒效果，以获得抗突变病毒药物；将突变病毒人工接种不同品系的鸡及抗性动物，以研究囊膜突变对致瘤性的影响。本研究将为ALV－J生物特性提供重要补充，并为防治当前日趋严重的ALV-J感染提供有力的科学基础和技术支撑。同时开辟了抗禽反转录病毒研究的新思路。

ALV-J是具有囊膜的反转录病毒，临床感染主要表现为免疫抑制、生长迟缓和多种肿瘤。由于ALV-J囊膜蛋白超变特性，至今未研制出效果明显的疫苗或药物。ALV-J的这种超变特性主要是由于病毒为适应环境选择压造成的，而选择压的不同可能会影响囊膜的突变规律。囊膜突变可直接导致其宿主范围、感染力及致瘤性的改变。为明确ALV-J在选择压作用下囊膜突变关键区及氨基酸变化规律，本研究以田间来源ALV-J感染病例，ALV化学抑制物和不同家禽品系宿主作为选择压来源，研究病毒在选择压力下的突变模式、突变位点及其突变规律；以此为基础筛选囊膜内保守序列，经RNA干扰方法确证其功能后，制备多克隆抗体，检测其病毒中和效果，以获得抗突变病毒的抗体性药物。结果：ALV-J的田间流行株进化情况及致瘤特点研究表明，ALV-J的氨基酸突变位点主要集中在SU蛋白中的hr2区，而hr1和vr3区只个别位点发生突变，vr2未发生任何突变。这些毒株3’UTR中rTM和E原件大部分缺失、DR1相对保守；3’LTR中R、U5区相对保守，而U3变异较大。田间毒株诱导的肿瘤谱包括髓细胞瘤、血管瘤、纤维肉瘤、胆管癌、成红细胞瘤和淋巴瘤多种肿瘤型，并且在同一只鸡体内呈现多种肿瘤型，说明ALV-J具有多潜能致瘤性。抑制物（叠氮胸苷，AZT）选择压实验结果表明，ALV-J在一定剂量的AZT的持续作用下，在SU蛋白内的两个位点，F189S和P250S，在TM蛋白内的三个位点，S313P，E376K和G428V发生了突变，其中F189S位于hr2区内。宿主选择压实验结果表明，ALV-J在感染第一个宿主时氨基酸序列发生了明显的变异，主要集中在hr1、hr2和vr3，其中hr2变异最明显，之后在依次感染火鸡、山鸡、鹌鹑时均未发生明显突变，证明ALV-J在第一代回归动物后获得了足够的感染能力，甚至可以感染抗性禽(山鸡和鹌鹑)，但仍不感染鸭子。结合田间毒株突变规律，可以证明SU蛋白内hr2区氨基酸突变是宿主范围扩展并引起多种肿瘤的决定因素。根据田间及选择压力下ALV-J毒株序列变化情况，针对gag、pol、env和LTR设计4个靶标siRNA 干扰序列，构建的重组表达干扰载体干扰ALV-J复制的效率分别达83%，78%，85%和74%。选择干扰效率最高的囊膜干扰序列，人工合成小肽，制备多克隆抗体，该抗体可有效中和ALV。