基于BIPES的微生物群落分析新方法研究

Determining microbial community structure and its dynamic change has been a bottleneck for many fields. The area has been significantly improved with many novel observations due to the development of determining 16S rRNA gene tags with 454 and calculating microbial diversity with new bioinformatic tools. Recently, we developed a method called barcoded Illumina paired-end sequenicng (BIPES), which had an order of magnitutue level higher throughput, lower cost, and higher accuracy comparing with the 454 approach. Our previous study has proved the feasibility of BIPES, and we have sucessfully resovled the bioinformatic problem of clustering millions of sequences. However, there are some shortcomings and factors potentially affecting the usage of BIPES. In this proposal, we will systematically assess the wet lab steps in the BIPES process, mainly focusing on sample preparation, DNA extraction and purification, PCR, and next generation sequencing methods, therefore to find the best experimental conditions for the process; in addition, we will develop the quality control techniques including the external and internal standards; furthermore, we will develop the gapped paired-end tag technique, which is more flexible for selecting variable gene tags and can improve the taxonomy assignment efficiency of BIPES reads. The project aims to fully develop the BIPES method to be an accurate, labor-saving, and cost-effective method for studying microbial community. The method could be used in many fields involving human health, animal health, and environmental issues.

微生物群落结构及其动态变化分析是涉及众多学科的共性瓶颈技术。近期，该领域发展迅速，揭示了许多与人体健康以及环境科学相关的新现象。其关键原因是454测定16S rRNA基因短标签序列，进而计算微生物群落结构新方法的建立与运用。申请者原创开发BIPES法，它比454法的通量高数十倍，成本更低，并且准确性更高。前期工作已证明BIPES方法的可行性，并解决了百万条序列水平的聚类计算瓶颈。本项目针对BIPES一些潜在影响因素和不足之处，系统评估BIPES操作流程中的样品保存、DNA制备、PCR及测序等步骤的影响，探求最佳分析条件；建立内外标质控体系；建立非测通配对序列分析技术，拓展BIPES可变区的选择范围，提高序列标签的系统分类效率；从而将BIPES建成为准确、易用、高性价比的微生物群落结构分析手段。该方法可望在人体微生物组、微生物生态、环境及资源微生物、土壤及农业微生物等诸多领域获得广泛应用。

通过测序（尤其是Illumina平台）分析微生物群落近几年迅速发展。本课题对基于测序的微生物生态分析新技术（BIPES），从实验室操作及生物信息分析两个部分开展系统评估，优化分析流程，并将其应用于人体和环境微生物组研究。微生物群落结构及其动态变化分析是涉及众多学科的共性瓶颈技术。首先，本课题全面系统的评估BIPES实验流程的影响，包括采样、样品保存、 DNA 制备、 PCR、测序等步骤。通过比较不同的商品化试剂盒和直接煮沸法在提取的DNA所反映的群落结构和多样性上的异同，阐明了煮沸法和Qiagen等试剂盒法取得相似的菌群结构，降低成本，提高效率。第二，本课题采用已知质粒和样本建立内、外标质控体系，有利于提高分析结果的可靠性。第三，本课题经比较不同PCR区段对微生物组数据分析影响，发现不同的PCR区段，对alpha多样性指数影响较大，其中Shannon相对于Chao, PD更稳定一些。对beta多样性分析，不同PCR区段对PCoA分析影响较小，能够得到稳定、可比较的结果。对菌群结构，不同的PCR区段，也呈现较大的差异。当寻找差异种属时，同一组数据内部可以得到近似的结果，但不同PCR产物混合做荟萃分析时，则会出现混乱。第四，本课题建立了一种新的微生物OTU聚类新技术，解决了微生物群落分析中一个关键但又被长期忽略的稳定性问题。最后，本方法还应用于多组人体和环境数据分析，包括粪便、阴道拭子、痰液、红树林底泥揭示不同生境的微生物组成。就该课题组内容，课题组已经发表SCI论文10篇，其中通讯作者论文包括Microbiome（IF9.0），Journal of the American Heart Association（IF5.1）等期刊；出国访问2人次，国际会议2人次，国内会议3人次。受中国生态学会微生物生态学专业委员会委托，课题组多次举办微生态分析方法培训班，并于2015年面向全国多家著名单位举办微生物组学高级研修班，推广相关技术的应用。