基于元转录组中核糖体RNA的微生物群落结构分析

基于核糖体RNA"通用"引物的PCR扩增是微生物群落结构分析的主要方法，但"通用"引物覆盖度的限制使得在这种分析过程中会遗漏部分微生物类型。本课题中将开发不依赖于"通用"引物PCR扩增的、基于元转录组中核糖体RNA的分析微生物群落结构的新方法。通过现有元转录组分析方法的改进，使得此方法可应用于多个样品的同时检测和微量RNA样品的分析，并与RNA稳定同位素探测技术相结合可分析特定功能微生物群落结构。我们将验证此方法的准确性后应用于各种土壤和水体样品的整体微生物或特定功能微生物群落结构分析。此过程中将开发适用于从元转录组数据中筛选核糖体RNA来分析群落结构的软件系统，并从这些元转录组数据中挖掘以前常用分析方法未能检测到的新的微生物类型。随着高通量测序技术的普及，基于元转录组中核糖体RNA的分析微生物群落结构的新方法将会被广泛应用，并将扩展人们所认识的微生物的领域。

基于16S rRNA基因“通用”引物的PCR扩增是微生物群落结构分析的主要方法。但是”通用“引物并不能覆盖所有微生物，从而影响正确认识生态环境中微生物组成。本课题中我们建立了基于元转录组的微生物群落分析方法，并通过包括细菌、古生菌和真核生物的5种微生物小亚基rRNA的不同比例混合样品来分析了此方法的准确性。此方法不受样品中残留DNA的影响，避免了ＲＮＡ量较少样品分析过程中的DNA干扰。我们应用此方法分析了不同深度滩涂土壤中活性微生物的群落，并把此方法应用到微生物量较低的自来水、光滩水、叶表面、浴帘以及皮肤表面等各种环境样品，确认了此方法在广泛生态环境样品中的应用性。为了依据大量元转录组数据的群落结构分析，我们开发了可以从元转录组和元基因组数据集中筛选rRNA序列，分析微生物群落结构，并评估特定引物覆盖度的软件，并且应用于公共数据库中海洋元基因组数据集分析了海洋微生物群落特点。为了解决功能微生物群落结构分析中“通用”引物覆盖度较低，但提高引物简并度会降低PCR扩增效率的问题，我们开发了可利用高简并引物的两步ＰＣＲ方法，并利用此方法同时分析了氨氧化或甲烷氧化微生物的群落结构，扩大了覆盖面，并在此过程中发现了新的类型的功能微生物。我们通过对所测元转录组数据的分析，找到了与常用于细菌群落结构的引物不匹配的序列类型，并以此来设计引物，从环境样品中找到了不属于已有微生物（候选）门的微生物类型。在此课题中所建立的基于元转录组的微生物群落结构分析方法和可利用高简并引物的两步PCR方法可以应用于广泛的生态环境中有活性微生物群落结构和特定功能微生物群落结构研究中，并且在此分析过程中能发现新的类型的微生物。