VVE的万古霉素耐药性转换及传播机制研究

The van genes clusters are the main vancomycin resistance mechanism of vancomycin-resistant Enterococcus (VRE), which encode various functional proteins. A total of eight van gene clusters have been associated with acquired vancomycin resistance in enterococci,of which vanA and vanB clusters are dominant. Recently, outbreak of vancomycin susceptible enterococci containing vanA and capable of converting into a glycopeptide-resistant phenotype has been reported in aboard. Such strains were termed vancomycin-variable enterococci (VVE) due to this ability. In recent,the vanM clusters have been detected in China. The VVE isolates containing vanM were firstly found in our study, which have the ability of converting to vancomycin-resistant isolates causing the failure of vancomycin treatment.However, the mechansim is still unclear.In this study, we will continue to collect Enterococcus isolates in clinic and from intestinal colonization. The methods including multiplex PCR of van genes, susceptibility testing, vancomycin incubation experiment,PFGE and MLST, Whole-genome sequencing (WGS), plasmid replicon typing and so on, will be used to demonstrate the molecular mechanisms for in vivo switching into vancomycin resistance of VVE and horizontal spread of the van genes clusters. This study will supply the foundation of controlling VVE outbreak.

万古霉素耐药肠球菌（VRE）主要由van基因簇造成，可编码多种功能蛋白导致万古霉素耐药。获得性van基因簇有8种，以vanA及vanB基因簇为主。国外已出现携带vanA基因的VVE菌株（具备万古霉素耐药性转换能力：万古霉素敏感菌转换为耐药菌）的局部爆发流行。近年来我国出现了携带新发现的vanM基因簇的屎肠球菌局部流行，我们在前期研究中首次发现了携带vanM基因的VVE菌株，可导致临床万古霉素治疗失败，但其确切机制仍不清。本研究将继续收集临床分离及肠道定植的肠球菌菌株，多重PCR法筛选van基因，结合药敏及诱导试验，获得VVE菌株，采用MLST分型阐明VVE主要流行克隆及克隆进化；采用转座子序列分析、全基因测序、质粒复制子分型等方法，阐明我国VVE菌株及van基因型分布，揭示VVE菌株万古霉素耐药性转换以及传播机制。为我国VVE菌株防控提供科学依据。

万古霉素耐药可变性肠球菌(VVE)是一类携带万古霉素耐药基因而表型敏感，在万古霉素压力下具有转变为耐药表型能力的肠球菌。由于VVE易于逃脱检测筛查、散播耐药基因甚至带来临床治疗失败的风险。本研究旨在调查vanM + VVE的流行现状，并深入研究其耐药转变的机制。本研究采用PCR对1284株临床分离肠球菌进行vanM筛查，结果显示，vanM在临床肠球菌中的分离率为4.36%（56/1284；55株屎肠球菌和1株粪肠球菌）。绝大部分(54/55)vanM +屎肠球菌属于最重要的院内流行克隆复合体CC17。vanM通常由质粒携带，只有一株屎肠球菌vanM位于染色体上。定量逆转录PCR分析进一步验证了vanM基因在VRE菌株中的组成型表达水平比VSE菌株中高5.36倍以上。本研究结果表明，临床肠球菌中以沉默形式存在的vanM耐药基因簇成为杭州地区重要的万古霉素耐药基因储存库。对54 株携带不完整 vanM 耐药基因簇的VSE菌株进行万古霉素浓度递增的体外诱导试验，对获得的诱导耐药株进行药敏测定及接合试验。结果表明，有将近半数（25/54）的 vanM + VSE 具有转变为耐药表型的能力，即严格意义上的VVE。此外，菌株携带的 vanM 耐药基因簇的完整性会影响表型转变的潜力。挑选三株不同转座子类型VVE代表菌株进行后续研究。结果发现，与亲本株相比，诱导耐药株的vanM耐药基因簇序列没有变化，但整个耐药簇的拷贝数出现了数十倍（45 ~ 94倍）的增加。与亲本株相比，诱导耐药株vanM表达量增加了数十倍，而生长速率明显下降。本研究首次阐明vanM耐药基因簇以IS1216为接头的串联扩增，是vanM型VVE形成耐药的主要机制。此外，vanM耐药基因簇的扩增和累积，会造成基因重排、表达量增加和适应性代价。