新型万古霉素耐药基因簇vanM的传播及调控机制研究

万古霉素耐药肠球菌（VRE）近年国内分离率增高迅速。我们在VRE菌株中发现一种新型基因簇vanM（AAC,2010），该基因簇介导的万古霉素耐药性可通过接合试验发生转移，但Southern杂交显示转移前后vanM阳性质粒大小不同，存在质粒结构的改变，其机制有待明确。此外，携带该基因簇的菌株中既有VanA表型，亦有VanB表型，耐药表型差异的发生机制有待研究。本课题拟开展以下研究：①通过对接合转移前后大小不同vanM阳性质粒的全序列分析，了解耐药基因簇传播机制；②通过对不同耐药表型菌株携带的vanM基因簇的周边DNA序列及其表达水平比对，分析序列差异与耐药表型改变的关系，明确不同表型的形成机制；③采用基因定点突变、缺失以及蛋白质谱分析等技术筛选基因簇及其表达产物中与万古霉素耐药相关的关键蛋白及功能域，寻找新靶位。通过上述研究为控制细菌耐药性传播提供理论依据，为逆转VRE耐药性探索新途径。

耐万古霉素肠球菌(VRE) 自上世纪80年代首次分离以来，由于其传播迅速、治疗选择有限且经常伴有较高的致病率和病死率，已经成为公共卫生所面临的重要威胁。vanM基因由我们课题组在2006年分离自复旦大学附属华山医院的1株万古霉素屎肠球菌(VREfm)中首次发现，目前国内外相关报道较少。开展此型VRE的研究，可为其感染的防治提供一定的理论依据。.课题实施4年来，我们按研究计划完成了上海地区临床分离的70株VRE菌株收集，通过分子流行病学研究，明确了VanM型是上海地区VRE的主要基因型(64.3% [45/70] versus 35.7% [25/70])，该型VRE既可通过克隆垂直传播，亦可通过移动元件形式被敏感菌株摄入而水平传播；通过高通量测序技术及生物信息学分析，初步明确了vanM基因杂交条带大小变化为基因簇借助移动元件发生转移以及多拷贝串联结构形成所致；通过对不同耐药表型菌株携带的vanM基因簇的序列比对，发现基因簇拷贝数与耐药表型相关，高拷贝菌株，vanM基因的转录水平及耐药水平高，初步明确了耐药表型差异的形成机制。.此外，在研究万古霉素耐药基因传播机制过程中，我们发现磷霉素耐药性可伴随万古霉素耐药性转移，而肠球菌磷霉素机制尚无报道，通过对VanM型VRE菌株基因组全序列分析，在国际上首次明确磷霉素耐药基因新亚型fosB3是肠球菌对磷霉素耐药的主要机制，在我国肠球菌磷霉素耐药性形成中发挥重要作用。.通过计算机同源模建对vanA、vanM等基因编码蛋白的结构及功能进行了预测，并开展了基于分子对接的vanA、vanM编码蛋白抑制剂的虚拟筛选，获得一批有潜在活性的备选化合物，进一步表型筛选获得一种能部分逆转肠球菌万古霉素耐药性的化合物，初步明确vanM基因编码蛋白可作为逆转万古霉素耐药性的新靶标；根据vanA、vanM等万古霉素耐药基因的序列差异，我们还建立一种VRE检测方法.总之，通过课题开展已初步明确VanM型耐药基因簇的传播与调控机制，以及逆转万古霉素耐药性的新靶位，为此型VRE的防治提供了重要理论依据。相关成果已发表标注课题资助论文5篇（其中SCI论文4篇）；申请国家发明专利2项，授权1项；培养研究生3名。达到项目原定目标。