肠球菌磷霉素耐药新基因及磷霉素耐药传播机制研究

Because of the prevalence of multidrug-resistant bacterial infection and the development of new antibiotics always later than drug resistance, these old antimicrobial agents such as fosfomycin have been used to treat the infection of multidrug-resistant bacteria. Recently, the fosfomycin resistance of Enterococci has been increasing in China. It is the new challenge for the treatment of vancomycin-resistant Enterococcus(VRE) infection. The fosfomycin resistance and transmission mechanism in Enterococcus is necessary to be studied. However, the research on the fosfomycin resistance in Enterococcus is rare in the world. In our past study, thirty-one fosfomycin-resistant Enterococcus strains were detected among 47 VRE strains and 150 vancomycin-susceptible Enterococcus (VSE) strains, including 24 fosB-positive strains with unknown resistance transmission mechanism and the other 7 strains negative for all the known fosfomycin resistance genes. These strains may contain new fosfomycin resistance gene. We also have finished the whole genome of a fosfomycin and vancomyin resistant Enterococcus faecium strain. In this study, we will use the methods including the whole genome sequencing, plasmid sequencing, cloning and expression, gene knockout,genetic complementation test and so on, in order to reveal the novel fosfomycin resistance and transmission mechanism in Enterococcus. This study will provide scientific basis for the control of the fosfomycin resistance in Enterococcus.

多重耐药菌感染的不断增加和流行，新抗菌药物的开发落后于耐药发展，使磷霉素等"老药新用"已成为临床治疗多重耐药菌感染的重要手段。近年来我国临床分离肠球菌对磷霉素耐药性的出现和增加，使万古霉素耐药肠球菌（VRE）感染的治疗面临新挑战，急需明确其机制及耐药传播规律。国内外有关肠球菌的磷霉素耐药机制研究极少。本课题组前期研究中从47株VRE和150株万古霉素敏感肠球菌（VSE）中分离到31株磷霉素耐药菌株：24株由fosB基因造成磷霉素耐药，但其传播机制不清；另7株菌株目前已知耐药基因均阴性。极可能存在新的耐药基因。并已完成1株磷霉素耐药VRE菌株的基因组测序。本项目将在上述研究基础上采用高通量全基因组测序、全质粒测序、克隆表达、基因敲除、突变回补等方法，明确fosB基因移动元件，进行磷霉素新耐药基因定位及功能验证，系统阐明肠球菌磷霉素耐药及传播机制，为控制磷霉素耐药性的不断增加提供科学依据。

本课题组针对筛选到的31株磷霉素耐药肠球菌的磷霉素耐药机制及传播机制进行了研究, 其中26株菌株fosB基因阳性（19株fosB阳性VRE菌株，7株fosB阳性VSE菌株），其余5株菌株fosB基因阴性。其中筛查到的19株fosB阳性VRE菌株（18株fosB阳性屎肠球菌和一株fosB阳性鸟肠球菌）研究中发现：19株万古霉素耐药肠球菌，都含有vanA和fosB，对磷霉素和万古霉素均耐药，对利奈唑胺和替加环素均敏感。其中18株屎肠球菌属于8个不同的ST型，以ST78为主，但都属于医院相关的流行克隆CC17克隆复合体。滤膜接合试验结果确认了这19株fosB阳性菌株都能成功接合fosB基因以及vanA基因。并通过Southern杂交定位分析，其中10株菌株的fosB基因与vanA基因位于同一质粒上，且通过PCR分析，这10株菌株的fosB转座子位于Tn1546转座子内部，可共同发生转移。本研究采用三代测序（单分子实时测序技术），获得并首次报道了一个同时携带fosB与vanA的屎肠球菌质粒pEMA120的完整序列，并发现该质粒上含有两个拷贝的fosB。通过三代测序，我们在鸟肠球菌中也获得了一个几乎相同（99.99%相似性）的质粒pEA19081，由此暗示了该质粒可以在不同的种间进行传播。反向PCR证实，携带fosB的ISL3-like转座子除了存在于质粒中，还存在一种小环结构，可能是fosB转移过程中的过渡中间体。本研究设计了一种fosB内部酶切杂交的方法，用于已知序列质粒上fosB拷贝数的验证及未知序列质粒上fosB拷贝数的探索。除了fosB的相关研究，本课题组对于另外5株不含fosB且接合失败的磷霉素耐药肠球菌菌株均完成了全基因组测序，其中两株为三代基因测序。通过对S72和S137的全基因序列的注释，我们发现有一个长351bp的序列，被注释为FosX。它的氨基酸序列与已报道的单核李斯特菌中发磷霉素耐药因子FosX，相似性53%，覆盖度83%。但通过我们的克隆及药敏试验的功能验证，这段序列与磷霉素耐药无关。我们分别挑选了一株磷霉素敏感菌株的VRE和VSE菌株：A136和S64。利用磷霉素连续体外诱导试验，通过对诱导前后菌株的序列分析，找到了两个有意义的突变(G797T, G394T), 对这两个潜在磷霉素耐药有关的SNPs还有待进一步通过定点突变等技术进行验证。