microRNAs在氟和二氧化硫致动物雄性生殖功能损伤中的调控机理研究

生殖健康是关系到动物及人自身可持续发展的重大问题。SO2和氟作为我国最主要的环境污染物，常常共存于环境中，对动物及人雄性生殖健康产生极大损害。miRNA因其在机体中广泛的转录后调控功能成为当前生命科学领域研究的热点。项目组前期通过miRNA表达谱芯片研究结果提示，miRNAs极有可能在氟和SO2致动物雄性生殖功能损伤中起着重要的作用。因此，本项目主要是采用QRT-PCR对miR-34c，miR-16，miR-106a等10个极可能在睾丸组织中时空差异表达的miRNAs进一步验证；同时，运用二维电泳及质谱手段从蛋白组学水平上筛选和鉴定睾丸中差异表达的蛋白质，并与特异miRNA预测的靶基因蛋白进行对比分析，运用免疫组化、蛋白印迹对共同表达的蛋白进行定性和定量研究，旨在阐明miRNAs在氟与SO2对动物雄性生殖功能损伤中的调控机理，为进一步筛选特异性标记物和药物靶标提供理论依据。

生殖健康是关系到动物及人自身可持续发展的重大问题。SO2 和氟是最常见的环境污染物，且共存于环境中，对动物及人雄性生殖健康产生极大损害。已有文献报道，miRNA在人与鼠睾丸组织中也有大量高丰度或特异表达的miRNAs，参与生殖功能调节。然而，目前对于二氧化硫和氟中毒是否会引起睾丸中miRNA表达的变化，国内外还未见报道。因此，本项目分别建立氟与SO2气及SO2衍生物不同时间和不同染毒剂量的各类大小鼠模型，进行了如下研究：（1）采用miRNA QRT-PCR技术对miR-34c，miR-34b，miR-34a等10个miRNAs检测发现，miR-34a，miR-15b和miR-322分别在氟、SO2及联合染毒小鼠睾丸组织中差异表达。其中，miRNA-15b和miR-322表达上调而miR-34a表达下调。（2）通过对4个miRNA靶基因预测网站和多种生物学信息学手段并行分析发现，特异性表达的miRNAs靶基因所涉及的几十个信号通路中，MAPK信号通路均排在首位。（3）采用定量PCR对氟和SO2染毒是否涉及MAPK信号通路进行研究。发现ERK1/2、JNK1/2/3、p38 和ERK5及转录因子GADD153、MAX、MEF2C、Sap1a、Nur77、JUN1、C-Jun、ATF、EIK-1等mRNA表达量均不同程度发生了变化，但不同动物模型下MAPK信号通路各支路的影响程度不同。总体上，P38和JNK2及下游转录因子C-Jun、MAX,GADD153，ELK-1等表达的变化最为明显。其余相关转录因子的表达与染毒剂量、时间和动物种属有关。（4）发明了一种专用于大小鼠睾丸组织样品全蛋白提取方法及双向凝胶电泳技术体系，建立了不同动物模型下睾丸双向电泳图谱，初步分析发现，氟中毒后睾丸组织中蛋白差异点可达50个以上。（5）采用定量PCR和免疫荧光对MAPK通路检测发现，氟中毒小鼠睾丸中erk1/2、NGF、Ras、Raf和MEK mRNA表达量分别下降了20%、43.3%、19.4%、25.2%、55.5%。在蛋白水平上，erk1/2、NGF、MEK表达量与基因水平上一致。而p38mapk mRNA表达水平升高，蛋白表达显著降低。综上，差异表达miRNAs及靶基因所涉及MAPK信号通路在氟和SO2致雄性生殖功能损伤中起着重要的作用，这对从分子水平上诊断和治疗具有重要意义。