MAPKs信号通路参与氟和二氧化硫对动物睾丸精子发生影响的调节机理研究

环境主要污染物氟和SO2的生殖毒性是关系着人和动物自身可持续发展与生态环境保护的重大问题。课题组前期通过差异miRNA生物信息学分析提示，氟和SO2对动物雄性生殖功能的损伤可能涉及MAPK信号通路。本项目从MAPK激活路径入手，通过巧妙构建氟和SO2染毒活体大鼠睾丸MAPKs抑制模型，采用酶联免疫、蛋白印迹、免疫荧光、定量PCR、FCM、透射电镜等技术对MAPK上游Ras、Raf-1、MEK活性，ERK1/2、p38、JNK和ERK5在睾丸中定位与磷酸化水平，下游调节因子PHAS-I、ATF-2、C-Jun、Elk-1、Nur77等磷酸化与mRNA表达，以及与生精细胞周期、血睾屏障维持之间的关系进行研究，旨在阐明ERK、JNK、p38和ERK5信号通路参与氟和SO2对动物精子发生影响的调控机理。其结果对从整体分子水平上揭示氟和SO2的雄性生殖毒性机制，进一步实施科学诊断和治疗具有重要意义。

氟和SO2作为两种环境中广泛存在的化学物，其生殖毒性是关系人和动物自身可持续发展与生态环境保护的重大问题。课题组前期通过差异miRNA生物信息学分析提示，氟和SO2对动物雄性生殖功能的损伤可能涉及MAPK信号通路。本项目紧紧围绕“MAPK信号通路如何参与氟和SO2对睾丸精子发生影响的调节”目标，通过应用多种动物模型和酶联免疫分析、定量PCR、蛋白印迹、双向电泳及质谱、透射电镜、高内涵筛选等多种技术手段进行了如下6方面研究：（1）氟和SO2对睾丸组织ERK1/2、p38、JNK和ERK5表达的影响研究；（2）氟和SO2导致睾丸MAPK通路激活与睾丸生精细胞凋亡及精子发生的关系；（3）氟和SO2对睾丸血睾屏障的维持与JNK Pathway的调节；（4）氟和二氧化硫染毒诱导睾丸组织差异表达蛋白表达的蛋白组学分析及与MAPK通路的关系。（5）MAPK信号通路在其它化合物生殖损伤中的调节作用及特异性参与氟和二氧化硫对动物睾丸精子发生影响调节的验证；（6）氟和二氧化硫对睾丸各类细胞影响的敏感性分析。结果发现，氟和二氧化硫气体及衍生物染毒后大小鼠睾丸组织MAPK信号通路MAPK水平上ERK1/2、JNK1/2/3、p38 和ERK5及上下游Ras、Raf、MEK、GADD153、MAX、MEF2C、Sap1a、Nur77、JUN1、C-Jun、ATF、EIK-1等30多个相关基因的mRNA和蛋白表达水平均发生了不同程度的变化。结合成功构建的MAPK整体及局部抑制活体动物模型和睾丸蛋白组学筛选出的19个差异表达蛋白分析结果，证实了P38、JNK和ERK MAPK通路在氟、SO2单独或联合致雄性生殖功能损伤中各自担负起着重要的调节作用，并筛选出一系列可作为候选生物标志物的基因或蛋白。同时通过三聚氰胺和碳纳米管暴露对睾丸MAPK通路各支路的不同效应，进一步证实了MAPK信号通路在调节氟和二氧化硫损伤中的特异性；项目还通过超微结构和9个构成蛋白表达检测，首次揭示了氟和二氧化硫染毒与睾丸血睾屏障损伤及MAPK通路调节之间的关系。从整体分子水平上阐明了MAPKs信号通路在氟与SO2对动物睾丸精子发生损伤中的调控机理。其研究结果将为进一步科学诊断和治疗环境中氟与二氧化硫等污染物对动物及人类雄性生殖功能损伤提供重要理论依据，同时，不仅圆满完成了项目研究内容，而且进行了广泛深入的国内外合作与交流。