HEV编码microRNA促进病毒复制及调控宿主天然免疫的机制研究

The mechanism of Hepatitis E virus (HEV) replication is still unclear. Viral encoded microRNAs may modulate both viral genes expression and host anti-viral defenses immunity system to benefit its replication. In our pervious study, a HEV encoded microRNA (miR-A6) was identified. Over-expression of miR-A6, HEV propagation was increased in vitro. The miR-A6 was expressed in special tissues during a productive viral infection in infected animals.In luciferase reporter assay, miR-A6 regulated the 3'UTR of SIRP-α, who play a critical role in innate immunity system against viral infection. Therefore, it is possible that miR-A6 regulate the innate immunity system to benefit the viral replication life cycles. In the present study, miR-A6 increase HEV replication in A549 and PLC/PRF/5 cells will be further identified by Real-Time qPCR, flow cytometry, western blot, and RNA interference (RNAi) by inoculated with HEV strain prevalent in Yunnan province. The role of miR-A6 in HEV replication, and how miR-A6 protect virus against innate immunity by regulation of SIRP-α will be found out.

戊型肝炎病毒（HEV）的复制机制尚不清楚。病毒编码的microRNA可以通过调控宿主细胞靶基因和免疫系统而创造适宜病毒复制的环境。我们前期筛选到一条HEV编码的microRNA（miR-A6），过表达miR-A6可以显著增强HEV在体外细胞的复制；同时miR-A6在HEV感染的动物体内呈明显的组织特异性和时序性表达。通过荧光素酶活性实验发现，miR-A6对在天然免疫调节中发挥着重要作用的SIRP-α具有调控作用。据此推测miR-A6可能通过调控宿主的天然免疫系统从而介导HEV的复制过程。本项目拟利用云南优势流行HEV毒株通过实时定量PCR、流式细胞术、Western Blot和RNAi等技术进一步验证miR-A6促进HEV在A549和PLC/PRF/5细胞的复制，明确miR-A6促进HEV复制的作用；并探讨miR-A6通过调控SIRP-α逃逸宿主天然免疫的作用机制。

戊型肝炎病毒（HEV）是严重危害人类健康的病毒性肝炎病原体，然而HEV的复制机制目前尚不清楚。病毒编码的microRNA 可以通过调控宿主细胞靶基因和免疫系统而创造适宜病毒复制的环境。信号调节蛋白α（SIRP-α）是HEV编码的miR-A6的靶蛋白，其在天然免疫调节中发挥着重要作用。为了探究HEV是否对SIRP-α的表达具有调控作用，我们将HEV接种A549细胞，结果发现，HEV可以诱导细胞内SIRP-α的表达。miR-A6也可以有效地诱导靶蛋白SIRP-α的表达，并且这种诱导作用是miR-A6所特异性的，miR-A6的突变体转染细胞后，降低了其对SIRP-α的诱导功能。此外，我们研究发现，miR-A6能够有效促进HEV复制，过表达SIRP-α同样可以促进病毒的复制，利用RNAi技术敲低SIRP-α的表达后，HEV的复制受到抑制。为了探究HEV与SIRP-α具有相互作用，我们对HEV的不同ORFs进行验证实验。结果发现，HEV编码的ORF3蛋白的D1结构域诱导SIRP-α的表达。我们通过免疫共沉淀实验进一步证实了二者的相互作用关系。随后，我们进一步分析了miR-A6调控宿主天然免疫的作用机制。 通过dsRNA类似物刺激细胞，产生大量IFN-β，接种HEV后发现，HEV可以有效的抑制细胞内IRF3的磷酸化，并抑制IFN-β的表达。我们将miR-A6转染dsRNA类似物刺激后的细胞，结果发现miR-A6能够有效的抑制细胞内IRF3的磷酸化，抑制IFN-β的表达。细胞敲除SIRP-α后转染miR-A6真核表达载体后，发现miR-A6对IRF3的磷酸化和IFN-β的表达的抑制能力明显降低。同时我们还发现，ORF3蛋白的D1结构域可以通过与SIRP-α相互作用，有效抑制细胞内IRF3的磷酸化，抑制IFN-β的表达。结论，HEV自身编码的miRNA-A6在病毒感染过程中，能够有效诱导宿主细胞内SIRP-α的表达，抑制宿主细胞内IRF3的磷酸化，抑制I型干扰素的合成，从而有效促进HEV的复制。本研究为HEV的复制机制提供了新的理论基础，为HEV体外培养提供新的思路。