活细胞中蛋白质寡聚化动态过程实时荧光成像与定量分析技术研究

活细胞中蛋白质分子动态行为的实时无损检测与分析是生命科学研究的迫切需要。本项目以细胞凋亡过程中Bax蛋白寡聚化为生物模型，发展一种新型的基于荧光共振能量转移(FRET)的活细胞中蛋白质寡聚化动态过程的实时荧光成像与定量分析技术。首先，构建类似各种Bax寡聚体的FRET基因质粒并提取纯化相应的基因蛋白；其次，进行FRET基因蛋白体系下的实验和理论研究，探索FRET效率随着各种寡聚体组份变化的规律，进而建立活细胞中蛋白质寡聚化动态过程的FRET实时成像和定量分析方法(Oli-FRET)；然后，运用Oli-FRET技术在单个活细胞中实时研究Bax寡聚化动态过程及其调控线粒体途径凋亡的准确分子机理。本项目不仅为蛋白质寡聚化这一重要生物学问题的研究提供关键的技术手段，而且将发展一种新型的可广泛用于活细胞中生物大分子动态行为研究的荧光实时检测与定量分析技术，对分子细胞生物学的研究和发展具有重要意义。

项目背景：.蛋白质分子间的寡聚化是基本的生命过程，是细胞信号转导的重要基本形式之一。发展活细胞中蛋白质分子间寡聚化过程的检测检测分析技术一直是细胞生物学的重要需要。荧光共振能量转移(FRET)显微成像术非常适合与在活细胞中研究蛋白质分子间的动态寡聚化过程。但是由于供受体间的光谱串扰使得活细胞定量FRET检测分析非常困难。.研究内容和重要研究结果：.1. 发展了基于二项式分布理论的多受体定量FRET分析技术，为分析蛋白质分子寡聚化提供了严谨的检测分析技术。研究结果发表在国际权威期刊 Appl Phys Lett(2014); .2. 发展了基于部分受体光漂白的活细胞FRET定量成像分析技术，特别适合活细胞中分子寡聚化过程的直接检测分析。研究结果分别发表在国际权威期刊 Appl Phys Lett(2012)和Microsc & Microanal (2013), 同时获得授权国家发明专利1项（ZL20111032899.8，2014）；.3. 首次发展了完全消除所有光谱串扰的定量FRET定量检测技术，适合光谱串扰较大的供受体对的定量检测围。研究结果发表在国际权威期刊 Microsc & Microanal (2012)；.4. 发展了一种全新的基于线性光谱分离的定量FRET分析技术，极大地提高了活细胞定量FRET检测的成功率。研究结果发表在国际权威期刊 J Microscopy(2015)和Micron(2015); .5. 建立了一套多功能定量FRET宽场显微检测系统，可实现多种定量FRET的检测。研究结果发表在国际权威期刊J Biomed Opt(2015)..6. 构建了基于FRET原理的高效还原性纳米氧化石墨烯探针，有望实现高效药物传递和光热联合治疗癌症，研究结果发表国际权威期刊 Biomaterails(2015) and Nanoscale Res Lett.(2015); .7. 研究了植物抗癌药物诱导肿瘤细胞凋亡分子机理，揭示了一些新颖的细胞凋亡分子调控机理。研究结果在Cell Signal, J Cell Physiol, Apoptosis等国际权威期刊(15篇SCI收录论文)。.小结：在本项目支持下，申请人获得授权国家发明专利1项, 发表SCI收录论文24篇,其中通讯作者论文22篇,超额完成项目申请书的各项研究内容和任务指标。