基于线性光谱分离的活细胞实时定量FRET显微成像技术研究

Fluorescent proteins (FPs)-based fluorescence resonance energy transfer (FRET) quantitation has two main issues:spectral crosstalks and random of FPs expression in cells. We recently proposed a novel and quantitative measurement of FRET that separates FRET quantitation into three independent processes: system calibration, spectral crosstalks corrections and live-cell FRET detection, largely improving the success rate of FRET quantitation inside live cell. This project aims to develop linear spectral unmixing-based real-time and quantitative FRET imaging microscopy to perform rapidly and real-time monitor the absolute FRET efficiency and donor-to-acceptor concentration ratio in single live cells. We will use these techniques to study the dynamics of the interactions among BH3-only proteins (Bid/Bim), proapoptotic proteins (Bax) and antiapoptotic proteins (Bcl-XL) in live healthy and apoptotic cells, respectively, to reveal the exact molecular mechanisms among the three types of proteins. The real-time and quantitative FRET microscopy developed here is sutable for a varity of fluorescence microscope and spectrophotometer, it thus must be an important tool for studying the spatio-temporal dynamics of aggregation, disassociation, component and activation of biomacromolecules in live cells.

基于荧光蛋白(FPs)的荧光共振能量转移(FRET)定量检测技术主要受困于供体受体间的光谱串扰及其在细胞中的随机表达。申请人最近提出了将检测系统校正和光谱串扰修正与活细胞FRET探测分离的思想，极大地提高了活细胞中定量FRET显微成像与分析的速度和成功率。在此基础上，本项目拟重点研究多种基于线性光谱分离的活细胞快速定量FRET显微成像技术，并研发适合在活细胞中同时快速定量检测FRET效率和供体受体浓度比的宽场显微成像系统；然后利用研发技术和系统分别在正常细胞和凋亡细胞中研究BH3-only蛋白(Bid/Bim)、促凋亡蛋白(Bax)以及抗凋亡蛋白(Bcl-XL)之间相互作用的时空动态行为，揭示三类蛋白之间的精确分子调控机制。本项目建立的活细胞定量FRET显微成像技术适用于多种荧光成像系统和光谱仪，必将成为研究信号转导过程中生物大分子复合物的聚合、解离及其组分定性和活性时空变化的重要工具。

随着光谱器件和技术的发展，光谱线性分离技术已经成为解析光谱成分的重要技术。本项目发展了分别基于发射光谱分离和激发发射光谱线性分离的定量FRET检测技术。重要的研究结果包括：1）发展了不依赖于激发光强度的基于发射光谱线性分离的定量FRET测量技术（IIem-spFRET），可以通过调节系统参量实现最佳成像条件下的定量FRET检测。基于该方法搭建了基于宽场显微镜和便携式光谱仪的活细胞IIem-spFRET检测系统，系统性能稳定，检测时间分辨率达到2s以内；2）发展了基于激发发射光谱线性分离的定量FRET检测技术（ExEm-FRET）, 并搭建了宽场显微ExEm-FRET成像系统。该系统性能非常稳定，抗干扰能力很强，鲁棒性强，可以实现低表达细胞的高灵敏检测。系统时间分辨达到3s；3）发展了基于强度比的双通道定量FRET检测技术和活细胞宽场显微成像系统，可实现ms量级的活细胞定量FRET动态检测；4）发展了基于FRET效率与供受体浓度比线性拟合分析的FRET双杂交分析技术，提高在活细胞解析复合大分子内部结构比例的检测分析效率；5）发展了基于热水还原GO的阳离子纳米基因高效传递载体，极大地提高了基因质粒的转染效率；6）利用定量FRET检测技术和系统开展了细胞凋亡分子调控机制的研究，取得一些新的认识。