基于寡核酸探针信号放大microRNA活细胞内实时、动态荧光成像研究

The early diagnosis and treatment of cancer have become harsh difficulties and have gained global attention. Recently, microRNA (miRNA) is shown to be a good early stage tumor markers, but it is low levels in cells and imaging difficulty. In general, Oligonucleotide probes are difficult to be permeable into cells membrane, moreover, the probes cannot achieve signaling cascade amplification without DNA enzymes in living cells. The project will explores signaling cascade amplification and real-time dynamic imaging method of miRNA in living cells with Watson-Crick base-pairing principle and DNA-graphene stacking interactions. It will be achieve probes permeable into the cell membrane and amplification reaction in cell. We hope that monitor the biological processes of miRNA with a simple and effective method in living cells. To investigate the role of miRNA in the regulation of early stage cancer, we will observe the regulatory network signals and behavioral processes of miRNA in the cell, explore the dynamic adjustment of tumor marker in miRNA signaling network, such as protein, gene and p53. We expect it that the progress in the early detection and diagnosis of cancer. It can contribute to the further understanding of life phenomena, cell behavior and disease occurs.

癌症的早期诊断与治疗已成为全球的关注热点和攻克难关。目前最新研究发现microRNA（miRNA）能够作为很好的癌症早期肿瘤标志物，但其在细胞内含量低、成像难。通常寡核酸探针进入细胞难度大，且进入细胞内的核酸探针在无DNA酶参与时往往不能实现细胞内miRNA信号级联放大。本项目利用DNA碱基Watson-Crick配对原理和DNA-石墨烯共轭堆积作用探索实现活细胞内miRNA信号级联放大和实时、动态成像方法。设计完成无DNA酶参与时核酸探针的跨膜及细胞内核酸扩增，以开发简单、有效监控活细胞内miRNA生物学过程的方法。通过miRNA上下游肿瘤标志蛋白、p53等的动态调节，观察miRNA在细胞内的网络信号调控和行为过程，探讨miRNA在肿瘤早期调控中的作用。期望基于此项目研究能够使癌症的早期发现和早期诊断获得进展，对于深入探讨生命现象的本质、解释细胞行为和疾病发生机制都具有重大意义。

针对癌症早期诊断的重大需求，项目选择癌症密切相关的肿瘤早期标志物miRNA 作为研究对象，考虑目前活细胞内miRNA 检测和成像面临的难题，利用现代分子生物学技术结合新型纳米材料实现活细胞内miRNA 信号级联放大，不需要DNA 酶参与，完成活细胞内低含量miRNA 的高灵敏检测；通过对活细胞内miRNA 的可视化荧光成像研究，实现了活细胞中miRNA 的实时监控，观察了miRNA 在调控信号网络中的动态变化，并促进了miRNA 作用机理的研究。为癌症的早期诊断和可视化成像以及动态调控等奠定了理论与技术基础。基于活细胞内信号放大分子生物学机制的研究，借助纸芯片、传统电极等开发了一系列生物传感分析检测方法。基于发夹探针介导的指数等温扩增开发了双循环扩增检测miRNA；基于内部滤波效应（IFE）诱导的硅纳米颗粒的荧光猝灭，开发了一种检测miRNA的简单方法；构建了定量分析miRNA和细胞表面叶酸受体（FR）表达的微流控纸基荧光传感器；实现了微流控纸芯片非小细胞肺癌EGFR突变的无创检测；基于G-四链体/ 氯化血红素辣根过氧化物酶-（HRP-）模拟酶性DNA催化的聚苯胺（PANI）的原位沉积，设计了用于p53基因检测的电化学生物传感器；基于氧化石墨烯和杂交链反应开发了小肽MUC1的荧光检测方法；实现了微流控纸芯片上电化学发光灵敏检测肿瘤相关小肽MUC1；利用微流控纸芯片同时定性、定量分析两种肿瘤相关蛋白CEA和MUC1；基于寡核苷酸探针设计了逻辑门同时分析Hg2+和Ag+；采用自组装方法成功制备了DEX-GO-Ti和DEX-rGO-Ti基底，为rBMSCs的形态、增殖和分化提供了一个合适的环境，实现了在DEX-GO-Ti底物上的rBMSCs比在DEX-Control和DEX-rGO-Ti底物上更高的增殖速率。