lncRNA-TUG1通过拮抗miRNA-145促进神经母细胞瘤增殖和转移机制的研究

The regulation of lncRNA and miRNA plays an important role in tumor development. Studies have shown that there are complex regulatory network between them. Researchers have confirmed the miR-145/HIF-2 pathway is important to neuroblastoma proliferation and metastasis. So far, the mechanism of the effect of mutual regulation between lncRNA and miR-145 on the proliferation and invasion of neuroblastoma is still poorly understood. Our pre-test showed that lncRNA-TUG1 promoted the proliferation of neuroblastoma, the target gene is miR-145, and transcription factor is Sp1. Accordingly, we propose the hypothesis: TUG1 and miR-145, Sp1 forming a feedback regulatory network, and effect the proliferation and metastasis of neuroblastoma by regulating the PRC2 and downstream HIF-2 alpha. To test this hypothesis, we using RT-PCR, liposomal transfection and siRNA to detect human neuroblastoma cells，tissue and nude mice, probing the mechanism of the effect of lncRNA -TUG1 on the progression of neuroblastoma by antagonistic of miR-145 from the molecular, cellular, tissues, and animal levels. This study will reveal the foundation of the proliferation and metastasis of neuroblastoma from this new viewpoint, and will provide new ideas for researching new targeting drugs for neuroblastoma.

lncRNA和miRNA在肿瘤发生发展中发挥着重要作用。研究表明，它们之间存在着复杂的调控网络。研究已经证实miR-145/HIF-2α通路调控神经母细胞瘤增殖和转移过程。迄今，lncRNA与miR-145相互调节进而调控神经母细胞瘤增殖和转移的机制知之甚少。我们预实验表明TUG1能促进神经母细胞瘤的进展，证实其靶基因为miR-145，转录因子为Sp1。据此，我们提出假说：TUG1与miR-145、Sp1构成反馈调控网络，通过调控PRC2及下游HIF-2α影响神经母细胞瘤的增殖和转移。为验证这一假说，我们将通过肿瘤细胞、组织及裸鼠，采用RT-PCR、脂质体转染和RNA干扰等方法，从分子、细胞、组织和动物水平探讨TUG1通过拮抗miR-145调控神经母细胞瘤进展的重要作用及其机制。本研究将从这个新视点为揭示神经母细胞瘤的增殖和转移机制奠定基础，为神经母细胞瘤的靶向药物治疗研究提供新的思路。

神经母细胞瘤是儿童最常见颅外实体肿瘤，约占儿童肿瘤死亡原因的15%。尽管采用综合治疗方法，预后仍不尽人意。因此，迫切需要阐明神经母细胞瘤发生、发展的机制。. 第一部分：通过本课题组前期微小RNA基因芯片的结果和PCR证实，miR-7在神经母细胞瘤组织中表达下调。在细胞水平，通过黏附实验、划痕实验、Transwell小室转移实验证实miR-7能够抑制肿瘤的进展，通过生物信息学预测、荧光素酶基因报告系统和免疫印迹实验证实CatK为miR-7的靶基因，miR-7通过靶向CatK发挥抑癌基因的作用。最后通过裸鼠体内成瘤实验再次在体内水平验证上述结论。. 第二部分：通过PCR检测神经母细胞瘤临床标本发现长链非编码RNA TUG1在晚期肿瘤中表达升高并与预后呈负相关。向神经母细胞瘤细胞株中转染TUG1表达质粒或者小干扰RNA后，EDU渗入法、克隆形成实验、Transwell、划痕实验证实TUG1促进神经母细胞的增殖、侵袭和迁移能力。通过生物信息学预测、荧光素酶基因报告系统、免疫印迹实验和细胞生物学实验证实TUG1通过结合miR-194发挥海绵样作用，促进SOX17的表达，从而促进神经母细胞瘤细胞的增殖和转移。最后，在裸鼠体内水平验证上述结论。. 第三部分：通过分析GEO数据库中88例神经母细胞瘤标本（GSE6476）的基因芯片信息，发现长链非编码RNA DLX6-AS1在晚期肿瘤中表达升高并与预后呈负相关，PCR检测临床肿瘤标本发现DLX6-AS1表达水平与GSE6476结果一致。向神经母细胞瘤细胞株中转染DLX6-AS1表达质粒或者小干扰RNA后，克隆形成实验、MTT实验、划痕实验、流式细胞术、和Transwell小室实验证实DLX6-AS1可促进肿瘤细胞的增殖和转移。通过生物信息学预测、荧光素酶基因报告系统、免疫印迹实验和细胞生物学实验证实DLX6-AS1通过结合miR-107发挥海绵样作用，促进BDNF的表达，从而促进神经母细胞瘤细胞的增殖和转移。最后，在裸鼠体内水平验证上述结论。. 本研究证实多种非编码RNA（microRNA和lncRNA）在神经母细胞瘤发生发展中其重要作用，为下一步临床上该肿瘤的早期诊断、提升治疗效果和预后的判断提供重要理论基础和研究靶点。