连翘酯苷与Smurf2在AAN信号通路中作用机制的研究

AAN与TGF-β/Smads信号通路密切相关。连翘酯苷诱生的干扰素γ和TGF-β/Smads信号通路有交叉点。为探讨连翘酯苷在AAN中的作用，构建AAN体内外模型，实时荧光定量PCR和Western blot检测Smurf2、TβRI、SnoN、TGF-β1和Smad7等基因mRNA和蛋白表达；免疫共沉淀检测Smurf2与Smad7、TβRI的相互作用；FCM观察Smurf2蛋白复合物随细胞周期变化的规律；免疫细胞染色结合LC分析Smurf2、Smad7、TβRI在细胞中的定位；将Smurf2-siRNA转染入RTECs或小鼠体内，实时荧光定量PCR和Western blot检测Smurf2、Smad7、TβRI及SnoN的表达变化。构建Smurf2、Smad7、TβRI载体，转染入小鼠RTECs，检测其表达变化及TGF-β1与胶原的分泌。通过差异蛋白筛选Smurf2信号通路中的新底物。

马兜铃酸I（AAI）引起的肾损伤受到国内外广泛关注。本研究结合已建立的马兜铃酸肾病体内外模型，一方面给与马兜铃酸肾病体内外模型定量的连翘脂苷A或者直接给与一定浓度的IFN-γ，另一方面利用分子生物学手段提高或抑制正常细胞和马兜铃酸肾病模型细胞中Smurf2、Smad7和TβRI，进一步阐述了连翘脂苷A对马兜铃酸肾病纤维化过程中的的作用机制，以及Smurf2和TGF-β1/Smad信号通路与马兜铃酸肾病的相关机制研究。.同时，本研究在已经建立的AAN动物模型的基础上，通过蛋白组学技术研究AAN小鼠肾脏蛋白组，试图从蛋白组学方面寻找AAN发生的相关线索。结果共鉴定出总蛋白510个差异蛋白，通过MetaCore 5.0软件对差异蛋白的生物学过程、小分子活性等的分析发现氧化还原生物学过程、氧化还原活性以及线粒体定位富集程度较高；对肾毒性的富集分析发现过氧化物酶体增殖，线粒体膜损伤导致的细胞凋亡，氧化应激，缺氧导致的细胞改变，缺氧等富集程度较高。Dab2蛋白在AAN发病过程中表达量总体呈现上升趋势，与转录水平一致；同时Dab2蛋白的定位也发生了变化，完成了从刷状缘到细胞质，再到细胞核的转移。.因此，TβRⅠ的过表达对于AAN造成的肾脏纤维化进程有一定促进作用，而干扰的表达可以有效缓解AAN的病程；直接高表达Smad7，或者通过连翘酯苷A诱生IFN-γ，提高Smad7蛋白的表达，均可阻止Smad2/3磷酸化，并降解TβRI，从而抑制TGF-β1/Smad信号通路，减轻AAI诱导的AAN，直接给与一定浓度的IFN-γ也可产生类似的效果，为AAN的研究和治疗提供新的实验方法和靶点。