微量样品中痕量植物激素的超高灵敏分析方法与装置

Based on novel analytical methods for trace plant hormones of gibberellins (GAs) and brassinosteroids (BRs), an automated sample preparation instrument, and applications on real plant samples, developed in our group, we propose an project to develop an in-situ & on-site sampling technologies of ultra-sensitive analysis of trace plant hormones in milligram samples with simultaneous determination of multi-components trace hormones, in order to meet with current challenges in fundamental plant research. Arising from the whole plant hormone analytical process, which consisted of sample preparation, LC separation and MS detection, these microextraction methods will be further developed and optimized. Study on hydrophilic and selective adsorbents, and high sensitive derivation reagents will be developed and screened for GAs and BRs. Combining these factors together, the minimum sample amount needed for trace hormones analysis will be decreased by 20-30 folds. The goals of this project are to simultaneously analyze GAs and other acidic plant hormones with the sample less than one milligram, to quantify BRs with sample less than ten milligrams, and to upgrade the automated sample preparation instruments for milligram samples. These methods and instruments can be applied for micro-size plant samples and the specimens collected in-situ & on-site from live individual plant or specific tissue. The instrument will also be demonstrated in Institute of Plant, CAS. Generally, this project will contribute to basic plant research in China, especially in trace plant hormone analysis of micro sample, with advanced, reliable, and independent methods and instruments.

本项目以申请者已成功发展的痕量植物激素（赤霉素、油菜素甾醇）创新分析方法、自动样品前处理装置、实际植物样品测试应用为基础，针对植物学基础研究的微量样品、原位实时以及同时检测痕量植物激素的现实需求，提出开展微量样品中痕量植物激素的超高灵敏分析技术及装置研究。项目从植物激素分析检测的全流程出发，创新植物样品萃取机理、制备高选择性萃取材料、筛选高效质谱增敏衍生试剂；综合提高样品前处理的绝对回收率、萃取纯化后样品的上样利用率、质谱离子化效率，从而降低样品使用量20-30倍。本项目将实现亚毫克植物样本中赤霉素等酸性激素同时检测，以及毫克级植物样本中油菜素甾醇的定量检测，适用于微量实验室样本和原位实时取样样本分析，并研制一套微量样品自动样品前处理装置，在中科院植物研究所做应用示范。从而为中国植物学基础研究，特别是植物激素分析，提供先进、可靠、自主的检测分析技术和装置。

（1）建立亚毫克植物样品中赤霉素等酸性激素同时分析方法：项目组建立了亚毫克级植物样品中痕量赤霉素定量分析方法，系统发展了微量植物样品无损前处理、高效质谱电离增敏化学衍生、超高效液相色谱分离系列方法。精确测定了1毫克鲜重水稻叶片中的8种赤霉素，并且发现在常规分析方法无法检出的GA 9可在本方法中顺利测出，其他赤霉素的测定结果与常规测定方法相近，充分展现本方法的可靠性和先进性。这也是国际上首次报道定量分析毫克鲜重植物样品中的赤霉素的方法。.（2） 建立毫克级植物样品中油菜素甾醇分析方法：项目组建立了毫克级植物样品中油菜素甾醇的定量分析方法，合成了更高灵敏度的衍生质谱增敏试剂，发展了更高柱效的液相色谱分离方法，并为南京农业大学完成实际样品分析。.（3） 研制自动微量植物样品前处理装置1套，并在植物所开展应用示范。项目组发现随着植物样品量的降低，样品前处理的装置和过程可以大幅简化：可以在单个试管中一步完成研磨、萃取、净化、衍生、定容，后续就可以直接LC-MS/MS进样分析。因此，不再需要发展专门的微量植物样品前处理装置，植物学研究者可以更容易、更直接的应用项目组开发的分析方法。.（4） 开展原位实时植物取样样品分析测试。项目组建立了活体植物样品中酸性激素的原位实时植物样品制备方法。制备了一种以多孔聚苯胺为表面的电纺丝材料，制成微型萃取棒，对不同酸性植物激素的萃取容量在0.1-10 mg，耐受植物活体中无机阴离子，在pH5-6的活体组织液中，酸性植物激素结合常数107-108 mL/mol。本方法空间分辨率为3-8 mm3，检出限60 pg/g。与传统的分析方法对比发现：茉莉酸、生长素结果相似，羟基肉桂酸活体测定浓度较高，赤霉素GA 7只能在活体中测到。.（5） 发表植物激素分析高水平学术论文5 篇以上；申请发明专利4 项以上：项目组已发表SCI论文6篇，申请发明专利4项。.（6） 培养博士、硕士研究生4 人以上。项目组已培养博士毕业生4名，吴倩、王璐、孟虎、郝亮；在读博士生2两名，邓婷、宋志花。