固态纳米孔单分子探测技术“窥探”退行性神经系统疾病：疾病相关蛋白团聚的动力学以及药物筛选研究

Nanopore single-molecule detection technique has become one of the most promising candidates in future third generation rapid and cost-effective gene sequencing research, which aims to fulfill one person genome sequencing in 24 hours by less than 1000 US dollars. It has many advantages such as high sensitivity, high throughput, no need to make markers or amplification. Solid-state nanopores made by micro/nano fabrication method can tune the nanopore size and are more stable in solution, therefore, they can be used to detect protein molecules other than DNA. Neurodegenerative diseases including Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease have much damage to human brains and health. Research states that those diseases develop with the aggregation process of certain protein. Until now, the method that can detect the related protein aggregation needs markers and takes much time and efforts. In this project, we plan to use solid-state nanopore biosensors to do fast, label-free and single molecule detection the protein system associated with neurodegenerative diseases including Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease. By translocating those proteins through solid-state nanopores, we can detect the aggregation level of protein molecules, the dynamic process of protein aggregation. We can also provide an effective interference-free method to screen and select effective medicine, which have great significance to human health and medical level of our country.

纳米孔单分子探测技术凭借其超高响应灵敏度、高通量和无需标记、扩增等优点成为第三代高速、低成本基因测序技术中最强力的竞争者之一。利用微纳加工手段人工制备的固态纳米孔具有尺寸可控、结构稳定等优点，扩展了纳米孔单分子技术的探测范围，使之能探测除DNA分子之外的蛋白分子。退行性神经系统疾病如阿兹海默综合症、帕金森综合症等与人类的健康休戚相关。研究发现这类疾病的病程发展都伴随着特定蛋白的纤维化团聚过程。目前，对这类蛋白纤维化团聚的动力学过程的研究所主要采用的荧光标记检测等方法均耗时费力，成本较高。本项目创新性地提出利用固态纳米孔传感器的单分子探测技术来探测与退行性神经系统疾病相关的纤维化蛋白体系，无需标记、快速地探测待测体系中蛋白的团聚程度，研究团聚的动力学过程，并提供一种高效、无干扰的药物筛选手段以期得到新的有效药物，这对国民健康和医疗科技水平的发展有举足轻重的作用和重大的前沿科学研究意义。

纳米孔技术作为一种无需标记的单分子方法，非常适合研究非匀质系统蛋白的实时团聚动力学过程，对于研究中间体的形成和相互转化过程非常便捷，对于认知退行性神经系统疾病相关蛋白的团聚以及病理过程具有非常重要的科学意义。我们将a-synclein蛋白进行了不同天数的培育，然后利用纳米孔技术对其进行探测，发现穿孔信号随着培育天数的增加而增大，充分说明了此类蛋白的团聚本质。然后对数据进行多高斯峰拟合之后，发现a-synclein蛋白在团聚过程中有四种中间体，而且四种中间体之间存在相互转化关系。大的中间体是由消耗小的中间体逐步增加的，小中间体作为大中间体长大的种子存在。并且我们指出了磷脂层可以加速蛋白团聚的机理。通过简单的tween 20修饰，纳米孔可以在pH 4.0-13.0 的巨大跨度下，对不同分子（DNA，蛋白，生物复合体）等诸多不同待测物进行单分子探测，大幅拓展了固态纳米孔的适用范围，提供了一种普适有效的探测技术。通过纳米孔实验充分证明了N端乙酰化有效阻止了a-synclein蛋白的团聚。在实验中我们发现当用直径与蛋白质直径相似的纳米孔探测不同蛋白时得到的阻塞电流深度分布半高宽并不相同，我们推测这种分布的差异是由于不同蛋白灵活度不同而造成的结构上涨落一种反映。在随后的分析中我们发现阻塞电流深度分布的半高宽FWHM随着蛋白二级结构中α螺旋的含量增加而增加，而二级结构中α螺旋的含量高的蛋白灵活度更大。提出并发展了用固态纳米孔测量蛋白质灵活度的方法，此研究扩宽了纳米孔研究蛋白质的领域，证明了纳米孔不仅可以用来得到蛋白结构尺寸和带电量的信息，也能通过电流阻塞深度分布的半高宽得到体系中蛋白结构的分布，即蛋白的灵活度。它作为一种简单，快速，无需标记，易于集成的检测方法，将在研究蛋白质功能的机制，以及蛋白抑制剂，激活剂的筛选上有重要作用。