神经退行性疾病相关蛋白Omi对线粒体底物蛋白的调控机制研究

Neurodegenerative diseases are a group of disorders characterized by the relative neuronal degeneration, and their pathogenesis has not been elucidated. Studies have shown that mitochondrial dysfunction is closely associated with disease pathogenesis. Omi is a serine protease which is mainly localized in mitochondria and is linked to ND.However, whether Omi could impact the normal function of the mitochondria is not clear. By LC-MS technology, we found that GRP75 is a new Omi binding partner in mitochondria. Moreover, we confirmed that Omi could cleave the N-terminal of GRP75 in my pre-experiments. We speculate that this cleaves is necessary for the mitochondrial function of GRP75, which may be a new mechanism underlying Omi-mediated regulation of mitochondrial function. In order to confirmed this speculate, we will use a variety of approaches, including molecular biology, cell biology, and pathological approach, to investigate the regulation of GRP75 by Omi in vitro, in cellular model, and in animal model, respectively. Meanwhile, we will explore the role of this regulation in the mitochondrial function, neuronal activity and ND pathogenesis. This study will be developing the new function of Omi in mitochondria, and contribute to the understanding of mitochondrial dysfunction involved in ND pathogenesis, and thus provide new ideas for the treatment of diseases.

神经退行性疾病（Neurodegenerative Diease,ND）是一类由神经元退变而引发的神经系统疾病，其发病机理尚未阐明。研究显示ND的发病多与线粒体功能缺陷有关。Omi是一种主要定位于线粒体的丝氨酸蛋白酶且被证实与多种ND相关。但是，Omi对线粒体的正常功能有何影响尚不明确。我们前期预实验运用液质联用技术找到了Omi在线粒体上的新结合蛋白GRP75并证实Omi对GRP75蛋白的N端有切割作用。我们推测这种切割有利于GRP75在线粒体上行使保护功能，这可能是Omi调控线粒体功能的一个新机制。为证实以上推测，我们将采用分子生物学，细胞生物学，病理学等技术分别从体外-细胞-动物三个层面上来检测Omi对GRP75的调控作用，同时观察这种调控对线粒体功能，神经元活性的影响。本研究开拓了Omi在线粒体上的功能，并有助于理解线粒体功能缺陷与ND发生之间的关系，进而为治疗疾病提供新的思路。

神经退行性疾病是一类由神经元退变而引发的神经系统疾病，其发病机理尚未阐明，研究显示ND的发病多与线粒体功能缺陷有关。Omi是一种主要定位于线粒体的丝氨酸蛋白酶切被证实与多种ND 相关。 但是, Omi对线粒体的正常功能有何影响尚不明确。通过液质联用技术我们找到了Omi 在线粒体上的多个结合蛋白，其中包括HAX-1 和GRP75. 进一步研究结果如下：.（一）我们发现在OGD/R细胞模型与tMCAO/R动物模型中Omi蛋白表达上升，Hax-1蛋白表达下降。N2a细胞敲减Omi，OGD/R下Hax-1表达上升。N2a细胞加入蛋白酶体抑制剂MG132或自噬溶酶体抑制剂Bafilomycin A1处理后，OGD/R下Hax-1蛋白水平没有明显上升，表明Hax-1降解与泛素蛋白酶体系统或自噬溶酶体系统关系不大。免疫荧光实验表明Omi与Hax-1都定位于线粒体。TMRM与Hoechst染色表明，N2a细胞过表达Hax-1或加入UCF-101处理后OGD/R下线粒体膜电势恢复，细胞核皱缩减少，活化型caspase-3水平降低，凋亡减少。Western blot与TTC染色发现UCF-101作用下，鼠脑缺血皮层Hax-1蛋白水平回升，活化型caspase-3降低，脑梗死体积减少，表明UCF-101在脑缺血再灌注损伤发生中具有保护作用。.（二）我们发现Omi的新的线粒体底物蛋白GRP75。（1）结合和切割实验证实了Omi可以通过结合切割GRP75的N端从而促进其成为在线粒体上有功能的成熟形式。 （2）在mnd2鼠中和Omi基因沉默的SH-SY5Y及N2a细胞中GRP75的全长形式含量异常增高，并且在N2a细胞中当过表达野生型Omi后GRP75的成熟形式蛋白含量显著增加，而过表达突变形式Omi却没有任何影响。（3）Omi缺陷引起GRP75线粒体定位显著减少。线粒体的功能测试显示线粒体功能异常。重新表达野生型的Omi可以成功逆转这种表现。. 综上可知，Omi在调控线粒体功能上起到重要作用，在外界压力刺激，如脑中风情况下，Omi通过切割抗凋亡蛋白Hax-1从而加剧脑中风的损伤，而在正常生理条件下，Omi对维护线粒体的正常功能必不可少。我们的研究以与疾病密切相关的蛋白入手，通过深入研究，我们弄清楚了疾病相关蛋白在病理和正常状态下的功能，这位进一步开发以此类蛋白为药物靶点提供了