肿瘤相关成纤维细胞调控ISGs重塑实体肿瘤微环境I型干扰素抵抗的分子机理研究

Tumor promoting inflammation and immunosuppression are emerging hallmark of tumor microenvironment (TME), however, they are paradoxical. Cancer associated fibroblasts (CAF) has played important role in the switch of them. It is still unknown the exact mechanism of the switch between inflammation and immunosuppression. Based on our previous study, it was shown that fibroblast activation protein which is selectively expressed on CAF could downregulate the expression of ISGs (Interferon Stimulating Genes) including RIG-I, ISG-15, STAT-1 and ect. Importantly, FAP can suppress the production of IFN-β in fibroblasts induced by poly I:C and resist the anti-proliferation effect of IFN-α. CAF may make switch between inflammation and immunosuppression by this mechanism, which is the hypothesis we intended to investigate. In this study, we will investigate the phenotype of CAF by OMIC based method and formulate the markers of CAF which are associated with immunomodulation. The expression regulation relationship among CAF, ISGs and type I interferon related signal pathway was explored by CRISPR/CAS 9 and western blot. We will validate the effect that FAP suppresses the production of type I interferon and resist the anti-proliferation effect of them through inhibiting the expression of ISGs. Finally, the mechanism we obtained in vitro will be validated in animal models. This study aim to elucidate the molecular mechanism of immunosuppression function of CAF in TME and guides clinical cancer therapies and makes prognosis for patients.

炎症和免疫抑制是肿瘤的两大特征，其形成相互矛盾。肿瘤相关成纤维细胞（CAF）在二者之间转换中具有重要作用，但机理尚未阐明。成纤维激活蛋白（FAP）是CAF特异表达的膜蛋白，前期工作发现：FAP能下调RIG-I、ISG15和IRF7等干扰素诱导基因表达，并抑制由PolyI:C诱导的IFNβ的产生和抵抗IFNα对成纤维细胞的增殖抑制。该发现可能是CAF实现促炎和免疫抑制转换的重要机理，也是本项目探讨的科学问题。本研究拟通过系统生物学方法研究CAF的表型，梳理与免疫调节相关的标识。利用基因编辑和免疫印迹等技术在FAP、干扰素诱导基因和I型干扰素相关通路上探讨其调控关系。证明FAP抑制干扰素诱导基因的表达形成肿瘤微环境对I型干扰素产生缺陷和抵抗的生物学效应。最后，在动物模型和临床样本上验证三个关键环节对免疫抑制形成的重要作用。以期阐明CAF促进肿瘤微环境免疫抑制形成的分子机理，指导肿瘤治疗和预后。

炎症促增殖和免疫抑制是肿瘤的两大特征，二者共存相互矛盾。肿瘤相关成纤维细胞（CAF）在二者之间转换中具有重要作用，但机理尚未阐明。我们前期研究发现相比正常小鼠成纤维细胞RIG-I、TRAF6等干扰素诱导基因（ISGs）在小鼠乳腺癌来源的CAF细胞和FAP高表达成纤维细胞系中表达下调，过表达FAP能抑制由PolyI:C诱导的IFN-β的分泌和抵抗IFN-α对成纤维细胞的增殖抑制。CAF是肿瘤微环境中丰度最高的基质细胞，它可能通过与肿瘤细胞相互作用和旁分泌作用广泛地参与炎性促增殖和血管新生。我们通过四年系统的研究，探索了CAF在炎性促增殖和血管新生中的关键功能和机制，完成了相关的研究任务，主要发现如下：1）我们通过对上皮肿瘤来源的CAF进行测序，通过对测序数据进行权重共表达网络分析和Pearson共表达网络分析发现成纤维激活蛋白（FAP）、Vimentin和S100A4可能是CAF细胞的重要分子标志。我们进一步分离和培养了4株上皮来源肿瘤的CAF细胞，在CAF上利用免疫荧光和Western Blot对分析所得的FAP、Vimentin和S100A4等标志进行了验证；2）利用慢病毒系统建立稳定表达FAP的人成纤维细胞系（FAP-BJ、FAP-HFF），结果发现FAP能显著促进成纤维细胞增殖。将FAP过表达的成纤维细胞、CAF与肿瘤细胞进行共培养和混合接种至裸鼠皮下，结果证明FAP过表达的成纤维细胞和CAF能在体内外显著促进肿瘤的增殖和血管新生；3）用转录组测序、生物信息学和免疫印迹等对人上皮来源的CAF和正常成纤维细胞进行了差异表达基因分析，分析发现CAF发生了EMT的转化，进一步分析揭示FAP可能是驱动成纤维细胞EMT转化的关键，并且FAP能促进IL-6和SCUBE3等炎性分子的表达，机制研究初步解析了差异表达的IL-6和SCUBE3可能通过旁分泌作用促进肺癌细胞的增殖；4）在体内外证明了FAP过表达的成纤维细胞系和上皮肿瘤来源的CAF能通过分泌IL-6和SCUBE3等炎性分子显著促进肺腺癌的血管生成能力；5）在临床标本上验证了FAP的表达，其表达与患者生存预后具有正相关关系。本研究解析了FAP作为CAF的核心标志可能是驱动恶性转变的关键基因，FAP可能是抑制上皮来源肿瘤增殖和血管新生的关键靶点。