HBx蛋白调控miRNA介导乙型肝炎病毒天然免疫逃逸的机制研究

Persistent infection of HBV is one of the most important human health problem, however, the mechanism of the infection is still unknown. The previous results of our study have indicated that HBx which was coded by HBV genome could downregulate IL-6R in hepatocytes. We speculated that HBx may have mediated the innate immune escape of HBV and the establishment of persistent infection. Through bioinformatics analysis, we found that miR-23 family and related miRNA may be the key regulators in this process. In this study, we intended to analyze the differentiated expression profiles of miRNA and mRNA between HBV producing cell lines, HBx expressing cell lines and their maternal cell lines. We would explore the regulation network in HBx, miRNA and IL-6R by employing qRT-PCR and western blot. Moreover, we also investigated the resistance of HBx to anti-viral effect of IL-6 by MBL and HNF pathways. Finally, we would validate the mechanism of HBx mediated innate immune escape in clinical samples. By the results of our study, we intended to elucidate that HBx could modulate the host immune response and facilitate immune escape of HBV. Our study not only could provide new target and approaches to HBV treatment and prevention, but also to help us to establish long-term study direction and provide important foundation.

慢性乙型肝炎是危害人类健康的重要疾病，但其慢性感染机理尚未完全阐明。我们在前期工作中发现，HBV编码的X基因能显著下调IL-6R在肝细胞中的表达，因而推测X基因可能参与HBV逃逸天然免疫清除进而形成慢性感染的过程。通过生物信息学的分析发现，以miR-23家族为代表的多个小RNA可能是X基因下调IL-6R的关键分子。本研究拟采用高通量测序对HBV产毒细胞、HBx稳转肝细胞和与其对应的母细胞差异表达的miRNA和mRNA进行系统分析，利用qRT-PCR和免疫印迹等方法在HBx、miRNA、IL-6R三个层次上深入探讨三者的调控关系，并全面研究HBx对IL-6抑制HBV复制和促进病毒通过MBL途径清除的抵抗作用。最后在临床样本中确证三者的调控关系，以期阐明HBx通过miRNA对宿主进行免疫调节并形成免疫逃逸的机理。本研究不仅为乙型肝炎防治提供新靶点和新思路，也为建立长期的研究方向奠定坚实基础。

乙型肝炎的感染机理尚未完全阐明。大部分人感染乙肝病毒后呈现一过性急性感染，并迅速恢复。少数人会形成慢性感染，慢性HBV感染最终导致肝硬化和肝癌。因此，阐明急性感染向慢性感染的建立机理是关键。那么什么大部分人在急性感染后病毒能清楚，只有少部分人形成慢性感染。病毒逃逸宿主免疫清除可能其中的重要原因。我们在前期工作中发现，HBV编码的X基因能显著下调IL-6R在肝细胞中的表达，因而推测X基因可能参与HBV逃逸天然免疫清除进而形成慢性感染的过程。本研究体外建立了HBx的过表达和敲除细胞模型。对细胞模型mRNA和miRNA进行了高通量测序和高级生物信息学分析。利用Western blot和qRT-PCR实验证明了miR-23a的表达与HBx的表达趋势呈现正相关关系。说明HBx能调控miR-23a的表达。通过荧光素酶报告基因系统证明，miR-23a能与IL-6R的3`-UTR区结合进而抑制报告基因的表达。通过过表达和干扰HBx的表达发现，HNF1α和HNF4α的表达与HBx呈现正相关关系。表明两个肝细胞核心调控因子的表达受HBx调控。干扰HepG2.2.15细胞中HBx的表达能同时下两个肝细胞核因子的表达和IL-6R的表达。但是，感染HBx并不能显著抑制HepG2.2.15病毒分泌。这可能是HepG2.2.15在体外合成病毒的机理与体内存在差异。在体外培养中加入IL-6的刺激，干扰HBx的表达能显著抑制HepG2.2.15细胞分泌甘露糖凝集素MBL。本研究收集了32例HBV感染阳性的肝癌患者和20例阴性患者的肿瘤组织。免疫组化检测了IL-6R的表达。研究发现HBV感染阳性和阴性两组患者的标本中，IL-6R的表达水平无显著差异。通过对转录组数据进行分析，发现HBx阳性表达细胞Src、RPS-27和c-myc表达上调。同时伴随HBx-SMMC7721和HBx-BEL7404两株细胞增殖能力显著增强。在培养体系中加入IFN-α，IFN-α能显著抑制两株细胞的体内外增殖。研究发现可能是IFN-α通过抑制Src、RPS-27和c-myc的表达进而抑制肝癌细胞增殖。这个途径可能是HBV促进肝细胞恶性转化的重要原因，同时也是IFN-α治疗肝癌的机理。本研究阐明了HBx通过miRNA对宿主进行免疫调节并形成免疫逃逸的机理。本研究为乙型肝炎防治提供新靶点和新思路。