COLD-PCR/HRM技术用于早期快速诊断耐药结核病的研究

The emergence and spread of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis, especially multi-drug resistant tuberculosis (MDR-TB) is the most serious problem for the control and prevention of TB worldwide. However, due to the weakness of conventional PCR, there is no detection method for the early and rapid diagnosis of drug-resistant TB. A recently developed PCR method called co-amplification at lower denaturation temperature PCR (COLD-PCR) enales preferential amplification of minority alleles from a mixture of wild-type and mutant sequences. In the present study, by sequencing single clones of 40 MDR-TB strains,special mutation types are selected to establish a novel COLD-PCR/HRM method, which is suitable for early and rapid diagnosis of drug-resistant TB.The new tool will provide invaluable theoretical and practical value for the effective prevention and control tuberculosis in China.

耐药结核病，尤其是耐多药结核病（MDR-TB）的出现和蔓延已成为全球结核病防治工作的重点和难点。但目前，由于传统PCR技术自身缺陷，尚缺乏针对耐药结核病患者早期快速诊断的检测技术。低变性温度下的复合PCR扩增反应(Co-amplification at lower denaturation temperature PCR, COLD-PCR)能够特异性地检测低丰度的突变体DNA，具有较高的灵敏性和特异性，快速、经济，操作简单等特点。本项目拟通过传统药敏方法筛选出40株MDR-TB，分离单克隆并利用基因测序技术分别对这些菌株的单克隆的耐药相关基因进行序列分析。从中选取具有特定突变类型的标准突变DNA，在此基础上建立适合于早期快速耐药结核检测的COLD-PCR/HRM，并通过检测300株结核分枝杆菌临床分离株进行验证，探讨其作为分子药敏检测方法的应用价值。该技术为中国耐药结核病患者的早期发现提

耐药结核病，尤其是耐多药结核病（MDR-TB）和广泛耐药结核病（XDR-TB）的出现和蔓延已成为全球结核病防治工作的重点和难点。作为遏制耐药结核的一个重要措施，对其的早期诊断对于提高耐药结核病患者的治疗效果以及控制其在人群中的蔓延具有重要作用。但目前，由于传统PCR技术自身缺陷，尚缺乏针对耐药结核病患者早期快速诊断的检测技术。低变性温度下的复合PCR扩增反应(Co-amplification at lower denaturation temperature PCR, COLD-PCR)能够特异性地检测低丰度的突变体DNA，具有较高的灵敏性和特异性，快速、经济，操作简单等特点。本课题首先研究我国耐药结核病的耐药相关基因的分子流行病学特征，建立与之相应的分子生物学检测方法，为我国耐药结核病患者的早期发现提供重要的检测依据。我们首先完成了对我国具有代表性的MDR-TB菌株的筛选，然后分别对这些菌株的耐药相关基因（rpoB、inhA、katG、ahpC-oxyR等基因）进行PCR扩增和测序，结果显示我国MDR-及XDR-TB菌株最主要的耐药突变位点为rpoB531,526和516位点，katG315和inhA-15，上述数据阐明了我国结核分枝杆菌耐药相关基因的突变特征。同时本研究优化了COLD/PCR-HRM技术的检测最低限从20%提高到1%。此外，本研究还建立了低丰度耐药结核分枝杆菌模型，并且基于该模型评价不同体外药物敏感性检测方法的效能，结果表明最低抑菌浓度实验检测效能最高，而传统分子生物学测序方法仅为10%。本研究还首次开发了适用于涂阴结核病的新检测方法（REPLI-PCR），REPLI实时荧光定量PCR对涂阴结核病患者标本的检出率为90%，显著高于传统荧光定量PCR52%的检出率。本课题的实施建立并优化了一系列结核病及耐药结核的早期检测方法，对我国的结核病防控有着重要的理论意义和实用价值。目前已发表本项目的SCI论文7篇，影响因子共计21.264，培养研究生2人。