必需基因Rv3582c作为抗结核药物新靶标的可行性研究

Drug-resistance tuberculosis becomes more and more serious. Tuberculosis again becomes one of the most serious threats to human health and life. There is a pressing need for the discovery and validation new antitubercular drug target and novel medicaments. MEP pathway is the only approach to the biosynthesis of isoprenes in mycobacterium tuberculosis (MTB). The pathway is closed related to the growth of MTB. The current research shows that the key enzymes of MEP pathway may become new antituberculosis targets. Rv3582c encodes an essential enzyme of the MEP pathway in MTB. This project is based on the lasted study of the essential gene, inhibitor screen model and novel inhibitors of Rv3582c. The mechanism of inhibited action will be expound by the inhibitory activity of Rv3582c mutant protein. The target differentially expressed strain will be constructed for target validation. A new drug target, Rv3582c an essential gene in mycobacterium tuberculosis, will be validated from molecular, cell, bacteria and animal level. The expected research results of the project are a novel antitubercular drug target. This product will provide with theory and technology for the development of new drugs target to Rv3582c. .The study is innovation by our laboratory. So far, there is no similar studies to be reported at home and abroad.

结核耐药日趋严重，使得结核病再次成为威胁人类生命健康的最主要传染病，发现和验证抗结核药物新靶标，研制新型抗结核药物迫在眉睫。MEP途径是结核杆菌生物合成类异戊二烯的唯一途径，与其生长代谢密切相关，目前研究表明该途径中的关键酶可能成为抗结核药物新靶标。Rv3582c编码了结核杆菌MEP途径中的一个关键酶。本项目拟在已验证了Rv3582c为结核杆菌必需基因，构建了酶抑制剂筛选模型，获得了Rv3582c酶抑制剂的基础上，分析抑制剂对Rv3582c蛋白突变体的抑制活性，阐明抑制剂的作用机理；构建Rv3582c基因的差异表达菌株，进行分子、细胞、细菌及动物水平的靶标验证研究，获得Rv3582c可作为抗结核药物新靶标的实验证据。预期的研究成果是获得可用于抗结核药物研制的新靶标，为抗结核药物提供理论和技术支撑..该研究为本实验室的原创性研究，国内外均无类似研究报道，具有极强的创新性。

结核病依然是威胁人类健康的三大传染病之一，加之耐药性的不断出现及同AIDS的共感染，使得这一疾病的治疗更为艰难。更为严重的是抗结核药物的开发极为艰辛，但近60多年来，除了二芳基喹啉外，没有开发出真正可用于临床的抗结核药物。因此，抗结核药物的开发迫在眉睫。MEP途径是结核分枝杆菌的必需途径，具有成为抗感染药物新靶标的潜力。Rv3582c是MEP途径的第3个酶，也是关键酶具有抗结核分枝杆菌的酶抑制剂尚未被发现。.本项目针对结核分枝杆菌的必需基因Rv3582c开展研究，构建了靶向于Rv3582c蛋白的药物筛选模型，并对7万多个不同来源的样品开展筛选，共获得了8个有开发前景的抗结核药物先导化合物。为了阐明先导化合物可能发挥相互作用的氨基酸，设计并表达了Rv3582c蛋白的关键氨基酸突变蛋白，结果显示突变的9个蛋白中，K27W，R157W和K215W完全使酶失活，同时用分子探针验证发现第107和140位氨基酸突变增强了抑制功能，而110位氨基酸突变不利于探针分子的抑制剂功能的发挥。随后构建了细菌水平的必需基因Rv3582c的基因差异表达菌株，并从基因，蛋白表达和菌体形态三个方面开展验证差异表达菌株，结果显示基因表达水平有明显的区别。高表达菌株的基因对应的mRNA约提高了27倍，而低表达菌株Rv3582c对应的mRNA约降低了140倍。利用Western Blot实验证明差异表达菌株的蛋白表达水平，低表达与野生型的差异比较明显，而高表达菌株和野生型的差异从灰度图上区别并不显著，说明蛋白的表达同基因的表达具有正相关。.国内外对这一方向的研究大多集中在疟原虫和除草剂方面，本项目从结核分枝杆菌出发获得了一系列的研究成果：完成了利用探针化合物，从分子和细菌水平验证靶标的研究目标，构建了动物水平验证靶标的模型。证明了Rv3582c具有开发抗结核分枝杆菌新药的潜力，也发现了8个新结构的化合物。项目从实施到结题培养了2名硕士研究生，在国内核心期刊发表论文2篇，获得授权专利1项。为后续的研究奠定了良好的基础。后续研究针对探针分子可以开展成药性优化设计与研究，针对靶标分子可以继续开展新药发现研究。