利用基因敲除家兔研究salusins影响动脉粥样硬化发生发展的机制

Salusin-α and salusin-β are considered to be processed from preprosalusin, an alternative-splicing product of the torsion dystonia-related gene(TOR2A), after frameshift reading and digestion at dibasic amino acids. Knock out animal model are needed to reveal the effects of salusins on the progression of atherosclerosis. Rabbits have been extensively utilized as an ideal model for atherosclerosis because of its size, easy manipulation, and extraordinary response to dietary cholesterol. In this project, TOR2A knock out rabbits,which will be created by transcription activator-like effector nucleases (TALEN) techniques, will be performed the subcutaneous continuous infusion of salusin-α,salusin-β or saline,respectively through osmotic mini-pumps in three groups knock out rabbits. Wide type rabbits infused of saline will be used as control group. All rabbits will be fed high cholesterol diet to induce atherosclerosis. We also plan to analyze how salusins influences lipid metabolism by comparing the plasma lipid level,lipoprotein profile and lipid related enzymes. The characteristics of atherosclerotic lesion will be compared in four groups by immunohistochemisty staining, Western Blot and real time PCR. In vitro study will be performed on cultured primary macrophages to analyze the cholesterol metobolism. Human umbilical vein endothelial cells will be used in transcriptomics study and the following signal pathway study. The perspective results of this study are expected to be useful for the identification of an novel drug target for atherosclerosis.

Salusin-α和β是同一基因(TOR2A)的选择性剪接产物。研究两者分别与动脉粥样硬化(AS)的关系，需TOR2A敲除模型,以排除内源性salusins干扰。家兔脂代谢特征与人相似，适合AS研究。本研究拟用TALEN技术制备TOR2A敲除家兔，在其皮下埋植微渗透泵，分别输注salusin-α、β或生理盐水，输注生理盐水的野生型家兔为空白对照组。所有家兔饲喂高脂饲料，诱导AS，观察家兔血脂、脂蛋白、载脂蛋白及相关酶水平，分析salusins对脂代谢的影响。比较四组家兔主动脉AS病变大小、免疫组化检测AS斑块组成成分，并结合组织学方法分析斑块稳定性。用细胞实验研究salusins对胆固醇代谢和炎症过程的影响，结合基因芯片技术筛选出可能的信号通路。用信号关键分子抑制剂干预细胞，研究信号转导机制。综合体内外研究，分析salusins影响AS发生的机制，为心血管疾病的防治提供新的理论和实验依据。

本项目基本按计划执行,在基因修饰动物模型制作过程中，调整了策略，TALEN和CRISPR/Cas9技术都进行了尝试。Salusins在体输注实验进行顺利，经过预实验，选择浓度，正式实验。Salusin α对血脂、血糖、胰岛素、谷草转氨酶和谷丙转氨酶的影响不十分显著。与对照组相比，Salusin α降低了动脉硬化大体病变阳性面积率（17% vs 48%）和主动脉弓镜下病变面积。免疫组化显示Salusin α也显著减少了斑块中巨噬细胞和平滑肌细胞的含量。Salusin α处理组胶原含量百分比显著高于对照组。检测了斑块MMP-1,2,9的表达，发现Salusin α对MMP-1和9的影响较小，但显著下调了MMP-2的表达， Salusin α影响了斑块的稳定性。体外细胞实验也确证了Salusin α对MMP-2,9的影响。体外培养vSMC实验发现正常培养细胞不会受到Salusin α处理影响。利用PDGF-BB刺激vSMC，模拟体内平滑肌在体内的情况，发现Salusin α可部分逆转PDGF-BB的作用，且在一定浓度内，具有剂量依赖，Salusin α在体外同样表现出抑制平滑肌增殖的生物学效应。这和体内实验观察到的一致。同样，划痕实验也显示，Salusin α对平滑肌细胞的迁移也有部分抑制作用。体内外研究均显示Salusin α可通过抑制平滑肌细胞的增殖和迁移，进而影响动脉粥样硬化板块的形成和进展。进一步的研究发现salusin α该作用是通过影响PI3k/Akt/mTOR 信号通路来实现的。通过salusin α和信号分子抑制剂联合处理体外培养平滑肌细胞，也证实了确实通过Akt而发挥了作用。另外 Salusin α输注降低了血压，但并未明显影响ALT和AST。Salusin α明显影响糖代谢，包括GIR和糖耐量试验，虽然相比对照组，Salusin α组血糖变化不大，但Salusin α改善了由于高血脂引起的胰岛素敏感性降低。但本研究并未发现Salusin β对动脉粥样硬化的明显影响。收集80分人血样，结果发现，Salusin α在糖尿病组降低，而Salusinβ在糖尿病组明显升高。本研究明确了salusin α和β与动脉粥样硬化发生发展的关系。尤其阐明了salusin α影响动脉粥样硬化发生发展的机制，为开发动脉粥样硬化新的治疗策略奠定理论基础。