微囊藻毒素干扰黑斑蛙性别分化和性激素合成转化的分子机制

Cyanobacteria bloom always occurred the period of growth and development for R. nigromaculata. This will lead to the potential damage to the growth and development of R. nigromaculata. However, the molecular mechanisms of the effects of MCLR on gonadal development and sex hormone synthesis of frogs remain unclear. In the current study, Rana nigromaculata were regarded as research object exposed to MCLR and to investigate the bioaccumulation of MCLR in tadpoles of different developmental stages. Determine the effect of MCLR on the expression of sex hormone receptor mRNA expression. Screen the key regulatory factors on the metabolism of sex hormone precursors by using transcriptome sequence technologyand to find out how MCLR alters the expression of key unknown genes and affects the conversion of sex hormones. The levels of GnRH, LH, FSH and other hormones in frogs before and after exposure to MCLR were measured, and the expression patterns of StAR and other classical regulation genes were analyzed to ascertain the mechanism of MCLR's influence on synthesis and transformation of sex hormones through the hypothalamus-pituitary-gonadal axis. This study will clarify the sensitive developmental stages of Rana nigromaculata that affect the sex differentiation, reveal the key molecular mechanisms affecting the synthesis and transformation of sex hormones, and provide theoretical basis for the protection of amphibious population and the assessment of the ecological health risk of MCLR.

蓝藻水华爆发常与黑斑蛙繁殖生长期吻合，这会导致黑斑蛙的生长发育受到藻毒素的潜在危害。但藻毒素如何干扰黑斑蛙的性腺发育和性激素合成目前缺乏研究，其中的分子机制尚不明确。本项目以微囊藻毒素（MCLR）进行暴露实验，研究MCLR在不同发育阶段蝌蚪和成蛙性腺中的蓄积特征；明确MCLR对性激素受体mRNA水平表达的影响；应用转录组测序从MCLR干扰性激素前体物胆固醇代谢、性激素转化和性腺发育3方面筛选未知关键因子，探明MCLR如何改变关键基因的表达而影响性激素分子转化；检测MCLR暴露前后GnRH、LH、FSH等激素含量，分析StAR等经典调控基因的表达规律，弄清MCLR通过下丘脑-脑垂体-性腺轴影响性激素合成转化的机制。本研究将明确藻毒素暴露对黑斑蛙性别分化的扰乱情况，弄清影响性别分化的敏感生命阶段，揭示影响性激素合成转化的关键分子机制，为两栖动物种群保护以及藻毒素生态健康风险评价提供重要依据。

蓝藻水华爆发常与黑斑蛙繁殖生长期吻合，这会导致黑斑蛙的生长发育受到藻毒素的潜在危害。但藻毒素如何干扰黑斑蛙的性腺发育和性激素合成目前缺乏研究，其中的分子机制尚不明确。本项目以微囊藻毒素（MCLR）进行暴露实验，首先定量比较了MCLR在黑斑蛙变态发育阶段的体重、鼻-排泄口长、后肢长、畸形率和死亡率等形态指标的变化，空白组的幼体畸形率为2.3%，1 μg/L MCLR处理组的幼体畸形率为6.4%；空白组的幼体死亡率是27%，1μg/L MCLR组的幼体死亡率是52%，1 μg/L MCLR暴露会显著增加雌性百分比至64.5%，证明其具有潜在的生殖毒性；开发了性激素的UPLC-MS/MS检测新方法，检测蝌蚪体内和黑斑蛙性腺中性激素小分子胆固醇（CH）、孕烯醇酮（PREG）、孕酮（PROG）、17α羟孕酮（17α-OHP）、雄烯二酮（A2）、睾酮（TS）和17β雌二醇（17β-E2）的含量，MCLR暴露后，雄性黑斑蛙血清内CH含量下降，孕激素PREG、PROG和17α-OHP含量下降，伴随着雄激素A2、DHT和TS含量下降，雌激素17β-E2含量上升，且均具有时间依赖性。通过Illumina测序平台对黑斑蛙精巢及肝脏组织的转录组测序和比较分析，MCLR暴露7、14和21天后，共鉴定216个、228个与319个显著差异基因，筛选出NR4A1、SR-B1与COMT与性激素合成相关的重要调控基因，通过Swissprot蛋白质数据库的注释找到了ER和AR两类固醇激素受体，通过引物设计和基因扩增，合成地高辛标记的分子探针，对其在性腺中的分布情况进行精准定位：AR在对照组表达较高，而在1 μg/L MCLR暴露组中处于较低水平，ERα和ERβ在对照组表达较低，1 μg/L MCLR暴露组中明显上升。检测MCLR暴露前后GnRH、LH、FSH等激素含量，分析StAR等经典调控基因的表达规律，弄清MCLR通过下丘脑-脑垂体-性腺轴影响性激素合成转化的机制。本研究明确了藻毒素暴露对黑斑蛙性别分化的扰乱情况，揭示了影响性激素合成转化的关键分子机制，为两栖动物种群保护以及藻毒素生态健康风险评价提供重要依据。