微囊藻毒素下调雄性大鼠雄激素（睾酮)合成和分泌的机制研究

The testosterone secretion deficiency could lead to male reproductive disorders, cardiovascular disease, diabetes and osteoporosis disease. Preliminary studies of our laboratory studies showed that microcystins (MCs) could significantly reduce male animals' testosterone synthesis and secretion. MCs down-regulation testosterone synthesis did not directly damage Leydig cells (the main place for testosterone synthesis), but most likely damaged the structure and function of the hypothalamic GnRH neurons. Based on previous work, the project is intended to carry out the following research: ① immune co-localization method for accurately positioning the distribution of MC-LR hypothalamic neurons, to confirm MCs can enter and accumulate in hypothalamic GnRH neurons; ② Establishing the GnRH neurons Oatp superfamily expression profiling and confirming the exactly carrier protein which mediated MC-LR into GnRH neurons by siRNA interference technology;③ Establishing the MC-LR exposed male rats model, to confirm damages of male rats hypothalamic GnRH neuronal and hazards of the hypothalamic - pituitary - testicular axis hormones regulating system after MC-LR exposure; ④ Establishing the model of MC-LR led to changes of the GnRH synthesis and pulse release, proving the molecular mechanisms that MC-LR affect GnRH synthesis and pulse release.

睾酮分泌不足可导致男性生殖障碍、心血管疾病、糖尿病及骨质疏松症。本实验室率先发现，淡水蓝藻产生的天然毒素-微囊藻毒素（MCs）显著下调雄性动物睾酮合成及分泌，其下调作用并非通过直接损伤睾丸间质细胞（睾酮合成的主要场所），提示可能通过损伤下丘脑GnRH神经元实现。本项目拟在前期工作基础上，开展以下研究：①采用免疫共定位法准确定位MC-LR在下丘脑神经元的分布，确认MCs能够进入下丘脑GnRH神经元，损伤其功能；②建立GnRH神经元Oatp超家族成员表达谱，运用siRNA干扰技术，确认介导MC-LR进入GnRH神经元的载体蛋白；③建立MC-LR染毒雄性大鼠模型，确认MC-LR对雄性大鼠下丘脑GnRH神经元的损伤及对下丘脑-垂体-睾丸轴调节系统的危害；④建立MC-LR导致GnRH神经元合成及脉冲性释放GnRH改变的细胞模型，探明MC-LR影响GnRH合成及脉冲释放的分子机制。

睾丸分泌不足可导致男性生殖障碍、心血管疾病、糖尿病及骨质疏松症。本实验室率先发现，淡水蓝藻产生的天然毒素-微囊藻毒素（MCs）显著下调雄性动物睾酮水平，其下调作用并非通过直接损伤睾丸间质细胞（睾酮合成主要场所），提示可能通过损伤下丘脑GnRH神经元实现。本项目在前期工作基础上，开展了以下研究： ① 分析MC-LR在雄性动物下丘脑组织和GnRH神经元中的分布及累计状况；② 建立GnRH神经元Oatp超家族成员表达谱，确认介导MC-LR进入GnRH神经元的载体蛋白；③ 确认和评价MC-LR染毒对雄性动物下丘脑GnRH神经元的损伤及其对下丘脑-垂体-睾丸轴激素调节系统的危害；④ 探明MC-LR影响GnRH神经元合成GnRH的分子机制。研究结果表明，MC-LR染毒动物后，可进入下丘脑组织，GnRH神经元是其作用的重要靶细胞；MC-LR使下丘脑组织中GnRH的转录水平明显降低，导致血清中GnRH、LH、FSH、睾酮含量随染毒时间的延长呈显著下降趋势。细胞学实验证明，有机阴离子转运多肽Oatp1a5是介导MC-LR进入GnRH神经元的关键蛋白；MC-LR经Oatp1a5介导进入GnRH神经元后，通过激活cAMP-PKA、Ca2+-PKC、MAPK通路，使GnRH转录增强子Oct-1、Otx-2、Pbx1a、Dlx-2水平降低，转录抑制子c-Fos、c-Jun 水平增强，从而抑制GnRH合成。进一步研究发现，MC-LR染毒GnRH神经元后，导致其miRNA表达谱发生改变，42种miRNA显著上调，59种miRNA显著下调，其中，miR-544-3p上调最为明显，上调10.67倍，miR-329-3p下调最为明显，下调9.5倍。在此基础上，本研究首次成功证明Prkar1a和Prkacb是miR-329-3p的靶基因；MC-LR可通过下调miR-329-3p使Prkar1a、Prkacb蛋白表达升高，进而激活miR-329-3p/PKA/p-CREB/c-Fos通路 ，抑制GnRH的合成。以上研究，为发现MCs内分泌毒性作用的分子靶点及可利用的、敏感的生物标志物提供了重要线索，为今后MCs雄性生殖毒性的相关研究奠定了理论基础。