高致病性猪蓝耳病病毒毒力因子的研究

高致病性猪蓝耳病病毒的致病机制尚不清楚。本研究拟在前期建立的一系列包括PRRSV经典弱毒株pAPRRS、高致病性 JX143M 及其细胞致弱株pJXM100的感染性克隆的基础上，建立同源（高致病性JX143M 及其细胞致弱毒JXM100）、异源（JX143M 与APRRSV 弱毒株）强弱毒株全长cDNA克隆之间基因组片段相互交换的嵌合感染性克隆，对拯救病毒进行鉴定后，通过动物试验，初步确定高致病性PRRSV 毒力因子所在区域。然后针对所界定的编码毒力因子，利用分段重叠延伸PCR（SOE-PCR ）或者突变PCR 的方法, 对强、弱毒之间的靶位点编码区的互换。通过动物致病力试验，最终界定高致病性PRRSV的毒力因子。为下一步研究病毒的致病机制打下基础。也为研发具有高交叉保护性的嵌合疫苗来预防HP PRRSV 以及持续多变的PRRSV流行株建立平台。

蓝耳病病毒的毒力因子的探寻仍无定论。本研究中，通过有限稀释法，将高致病PRRSＶ毒株JX143在Marc-145细胞上系列传代获得JX143的致弱株JXM100。建立了高致病性猪繁殖与呼吸综合征JX143株的致弱株，并探讨细胞致弱株JXM100与其亲本株之间的差异，为寻找可能的毒力因子奠定基础。通过RT－PCR，分4段克隆相互间首尾重叠并覆盖全长PRRSV 基因组cDNA 片断，最后进行CMV启动子的安装以及全长cDNA 克隆的连接装配入载体，命名pAJXM。通过质粒DNA 转染Marc-145细胞进行病毒拯救。之后对拯救病毒进行病毒学及分子生物学鉴定。结果表明，拯救病毒的生长曲线与亲本病毒相似。这一平台的建立，为进一步研究病毒致弱机制和寻找可能的毒力因子具有重要意义。对强、弱毒株进行全基因序列分析，利用DNASTAR 软件进行分析后，选取合适的酶切位点。以感染性克隆pJX143M和pAJXM为骨架，利用强弱株中共有的合适的酶切位点和SOE PCR技术构建了一系列结构蛋白和非结构蛋白的嵌合感染性克隆，经过质粒DNA 转染Marc-145细胞进行病毒拯救。之后对拯救病毒进行病毒学及分子生物学鉴定。.以PRRSV弱毒感染性克隆一pAPRRS作为主要骨架，将高致病性猪蓝耳病病毒江西分离株(JX143)的主要结构蛋白基因(ORF4—7)以及3 UTR区域替换入pAPPRS相应编码区域，构建了pSX12、p5NX12和p56N12三个PRRSV全长嵌合克隆。经DNA转染Marc145细胞后拯救出嵌合病毒，并对拯救病毒进行了病毒生物学特性的分析；选取拯救病毒v56N12和vSX12免疫29日龄猪进行免疫原性试验，结果表明，以v56N12免疫后抗体水平相对较低，故免疫原性相对较差；而vSX12病毒免疫后14 d血清ELISA抗体达到阳性值，免疫后28 d中和抗体效价从原来的l：5以下上升到1：15以上，说明vSX12具有良好的免疫原性并可进行免疫监测；免疫后28 d以强毒JX143株攻毒，结果vSX12免疫组未见发病，而未免疫攻毒对照组全部发病并有l头死亡，vSX12免疫猪攻毒后病毒血症持续6d后消失，而对照组攻毒后至少持续13 d，说明vSX12可对高致病性猪蓝耳病提供有效的免疫保护。本研究构建的三个嵌合病毒为探寻高致病性猪蓝耳病病毒的毒力因子奠定了基础。