蓝猪耳离体受精的探索

离体受精是将分离的精、卵细胞置于离体控制条件下进行体外融合，形成合子，再将"人工合子"培养成再生植株的实验系统。它不仅排除了体细胞组织对受精过程研究的障碍，而且还提供了直接观察雌、雄配子受精和受精后合子发育动态的技术平台，是研究高等植物受精和早期胚胎发生机制的有效方法。高等植物的离体受精目前仅在玉米和水稻两种单子叶植物中获得成功。蓝猪耳（Torenia fournieri）的胚囊部分裸露，对它的卵细胞分离工作相对较容易。在我们已成功地分离出蓝猪耳卵细胞和精细胞的基础上，本项目重点探索诱导蓝猪耳的精、卵细胞体外融合的细胞融合技术，并建立人工合子的单细胞培养技术，创建蓝猪耳的离体受精实验体系，填补双子叶植物离体受精实验体系的空白。

蓝猪耳是二胞型花粉，生殖细胞只在生长的花粉管中才分裂形成两个精细胞。用体内-体外技术培养出花粉管后，爆破花粉管即可释放出花粉管内含物，其中包括两个精细胞。在显微镜下两个精细胞表现出体积上的差异：其中体积较大的精细胞与花粉管的营养核相连，体积较小的精细胞不与营养核直接相连，而只与大精细胞连接。两个精细胞之间的连接比较紧密，需用微量酶液将两个精细胞分开，再用显微操作仪就可分别挑选出两个数量上百的精细胞群体。. 蓝猪耳胚囊部分裸露出胚珠，在光学显微镜下能清楚观察到卵细胞和助细胞的形态结构。用解剖和酶解-解剖两种方法都能分离出生活卵细胞和合子。后种方法恰当的酶浓度既能使分离更加容易操作，又对卵细胞没有致命伤害，能在短时间内分离出较多的卵细胞和合子。在显微镜下观察到分离的生活卵细胞和合子存在有差异：卵细胞的细胞质较集中，周围有较多大小不等的液泡；合子的细胞质分布较均匀，液泡明显少。用荧光素二醋酸酯（FDA）染色后合子细胞质的荧光强度明显高于卵细胞。合子的体积随着发育进展有一个收缩过程。蓝猪耳卵细胞的成功分离，为研究卵细胞受精前后生物学特性及合子激活机理等有性生殖生物学问题打下基础，也为建立蓝猪耳离体受精体系创造了条件。. 用体内-体外方法分离了蓝猪耳精细胞。用酶解和解剖方法分离了其成熟卵细胞。分离的精、卵细胞用电融合介导尝试了体外诱导融合。在合适的渗透压（6%甘露醇）和合适的氯化钙(0.04% CaCl2•2H2O)溶液中，用交流电场为30-35 V, 10-25 s使精、卵细胞排队；用直流电场400-600 V，45-50 µs的脉冲穿孔条件可诱导30%的精、卵细胞融合和70%以上的卵细胞之间的融合。尝试了人工合子的单细胞培养但未获成功。诱导蓝猪耳精、卵细胞融合的条件与玉米和水稻不同。