铝胁迫下土生隐球酵母钙调素结合蛋白的鉴定及其功能研究

铝毒害是酸性土壤上作物产量的主要限制因子，研究铝的生物毒性以及生物耐铝机理是解决酸性土壤上铝毒害问题的前提和基础。我们前期从云南茶园土壤中分离到一株耐铝能力较强的土生隐球酵母菌株，以该土生隐球酵母作为材料，通过SSH cDNA文库获得铝胁迫差异表达的钙调素（CAM1）EST序列，其表达随着铝处理时间的延长而增加，推测钙调素介导的信号途径参与铝胁迫响应过程。本项目以CAM1作为诱饵蛋白，从铝胁迫的cDNA表达文库中分离与CAM1相互作用的钙调素结合蛋白（CaMBPs），分析CAM1和CaMBPs在铝胁迫下的表达，在体内和体外研究CaMBPs与CAM1的结合特性，利用CAM1或CaMBPs抑制剂和将CAM1和CaMBPs基因转入铝敏感酵母验证它们在耐铝中的功能，揭示CAM1介导的信号途径在耐铝中的作用机理，丰富人们对信号转导途径参与铝胁迫响应的认识，为改良铝敏感作物提高耐铝毒能力提供理论参考。

在酸性土壤上铝毒害是影响农作物产量的限制因素之一。通常，解决铝毒害的方法是大量施用石灰来提高土壤的pH值，使游离铝沉淀。但是这种方法难以彻底解决土壤酸度和铝毒害问题，同时还存在着潜在的环境问题。提高酸性土壤上作物的产量有效且可持续的措施是筛选和培育耐铝毒作物品种。因此，研究耐铝毒机理、克隆耐铝毒基因可以为铝敏感植物的遗传改良奠定理论基础。.本项目前期研究发现钙调素及其信号途径参与对铝胁迫的响应，本项目克隆了钙调磷酸酶催化亚基基因（CNA），随着铝浓度的增加CaM和CNA基因的表达水平逐渐增加；通过原核表达纯化得到钙调素和钙调磷酸酶重组蛋白，分别制备了抗体；利用GST-pull down 验证CaM与CNA之间的相互作用；构建CaM和CNA转基因酵母，与对照酵母相比，CaM和CNA转基因酵母在固体培养基和液体培养基中的耐铝能力均增加。预测CNA上的CaM结合结构域以及与CaM结合的关键氨基酸残基然后用缺失和点突变对其进行验证。构建CNA全长基因、缺失片段∆CNAa和∆CNAb和定点突变基因CNA1、CNA2、CNA3、CNA4、CNA5的原核表达载体并获得纯化的重组蛋白，通过Far-western分析得知，∆CNAb可以与钙调素结合，而∆CNAa与钙调素没有结合，证明R436到S454为催化亚基上钙调素结合域。定点突变蛋白与钙调素的结合程度降低，且CNA1和CNA2突变蛋白与钙调素的结合量最小，证明I439和I443是与钙调素结合的关键氨基酸。通过测定CNA和突变蛋白磷酸酶活性，△CNAa重组蛋白的磷酸酶活力最低，CNA1和CNA2磷酸酶的活性非常低，说明钙调素结合域及钙调素结合关键氨基酸残基对酶活性的影响也非常大。这些研究结果丰富了人们对钙调磷酸酶与钙调素之间的互作及CaM信号途径参与铝胁迫反应的认识和理解。