百草枯的神经细胞内在化及亚细胞定位与PD发病机制的相关性研究

百草枯（PQ）高选择性地作用于中脑神经元引起其变性坏死，进而可导致与遗传性帕金森氏病（PD）相似的症状。本课题选择多巴胺能神经细胞系进行体外实验、选择小鼠进行体内实验，对定义为环境神经毒素的PQ与神经细胞膜结合的特异性、摄入细胞的路径、PQ细胞内在化后的亚细胞定位、PQ与细胞内因子的相互作用等进行研究。研究将采用荧光标记配体或/和抗体，同时借助共聚焦显微镜从形态学上观察PQ与细胞膜的结合能力和特异性；观察网格蛋白有被小泡和/或细胞膜穴样内陷结构对PQ摄取的特定有效途径；观察细胞器特异标记与PQ的形态关系。研究也将采用pull down及免疫共沉淀等技术方法检测PQ与细胞内因子及相关递质的相互作用，以推断PQ诱导PD的可能信号通路。PQ作用小鼠中脑黑质纹状体神经元的免疫组化分析进一步验证PQ的选择性中脑神经细胞的内在化。研究结果将对PQ诱导PD的发病机制、PD的预防和治疗提供科学数据。

项目的背景：百草枯（PQ）是一种目前仍应用于农业的除草剂，但是作为一种外源性毒素也对人体造成伤害。PQ慢性中毒可以累积到神经系统，特别是极易选择性地作用于中脑的多巴胺能神经元引起其损害；体外试验也观察到PQ能够导致多巴胺能神经元的凋亡。此外，由我们的前期研究也发现了环境毒素PQ与人类部分相关遗传基因的相互作用引发的多巴胺能神经元的凋亡，研究结果暗示了某些信号传导通路可能参与到帕金森氏病（PD）的发病机制中。然而，PQ与神经元是如何直接相互作用、PQ是否可以被神经元摄入细胞内、PQ摄入细胞内的亚细胞定位、以及进入细胞内PQ的代谢对于多巴胺能神经元变性坏死机制的提示等目前仍尚未明了。因此，本课题针对上述问题进行立项重点研究。研究内容：研究的主要内容包括：（1）PQ与多巴胺能神经元SH-SY5Y的特异性结合；（2）PQ在SH-SY5Y细胞中的内吞途径；（3）PQ的亚细胞定位研究；（4）PQ与细胞内分泌颗粒家族蛋白的相关性；（5）亚急性和慢性PQ诱导模型小鼠中脑PQ内在化和定位观察；（6）PQ与部分遗传基因之间的相互作用研究；（7）PD致病及易感基因多态性的分析。结果：PQ能够特异性地与人类多巴胺能神经元SH-SY5Y细胞结合；PQ主要通过Clathrin、而非Caveolae介导途径内吞入SH-SY5Y细胞中；内吞入SH-SY5Y细胞后PQ分布于不同的亚细胞器中，且依时间定位发生不同的变化；PQ特征性地定位在SH-SY5Y细胞质分泌颗粒家族成员3阳性的囊泡中；亚急性和慢性PQ诱导鼠模型中脑细胞中未观察到明显的PQ定位；PQ诱导的SH-SY5Y细胞模型中PIK3R3表达和亚细胞定位改变可能是Cas6依赖的；核基因组和线粒体组中均发现存在PD的致病和易感基因。关键数据：PQ可以与多巴胺能神经元SH-SY5Y结合，并且能够借助Clathrin途径内吞进入细胞；内吞进入细胞内的PQ显现出多种亚细胞分布特征，其中优势地与分泌颗粒家族成员3定位于相同的囊泡中；PIK3R3在PQ诱导的SH-SY5Y细胞凋亡模型中表达和定位发生改变；核基因组和线粒体基因组中存在PD致病和易感基因。科学意义：环境和遗传因素是导致PD发生的两大主要因素，借助PQ与多巴胺能神经元作用及部分遗传基因多态性的调查，对PD的发病机制进行探讨，提供了众多的有价值的数据，显示出其重要的科学意义。