卵膜糖蛋白与精子细胞特异结合提取混合斑中精子及其法医学应用研究

Personal identification for mixture stain with sperms and vaginal fluid is one of aporias in forensic medicine. At present, it has still been a main way to isolate sperms from mixture stain and subsequently detect its genetic polymorphism. However, a perfect and high-efficiency method for isolation of sperms from mixture stain has not been established yet. It is a prerequisite that the spermatozoa bind to the zona pellucida (ZP) matrix surrounding the oocyte during human fertilization. The ZP matrix in human is composed of four glycoproteins, which act as primary and secondary receptors binding spermatozoa to form specific and high-efficiency ligand-receptor binding complex. Next, the binding complex may induce the acrosome reaction in the ZP-bound spermatozoon and result in following physiological action. In this study, we shall apply the biological feature for specific recognization and binding to make the recombinants with each ZP gene and different vectors, to purify the fusion proteins and ZP alone as well as the fusion proteins digested with enzyme after the recombinants are expressed, to perform a binding assay with the recombinant ZP and spermatozoa both from seminal fluid and mixture stain kept at different conditions, and to specifically adhere ZP-spermatozoa complexes on Sepharose resins cross-linked with anti-tag antibodies, streptavidin or anti-ZP antibodies. Finally, we shall carry out an examination of DNA polymorphism based on short tandem repeat (STR) from isolated spermatozoa samples. In addition, we shall also use the de novo invention to caseworks in forensic medicine. Undoubtedly, the method implemented with optimization and inerrability will open up a novel thought for isolation of spermatozoa from mixture stain in forensic medicine.

精液与阴道液混合斑的个人识别是法医学鉴定中的难点之一，选择分离精子成分并对其遗传特征进行鉴定是目前的重要手段。然而，现今的研究方法还不能达到理想和高效的分离混合斑中精子的目的。人类受精过程是以卵母细胞外卵膜糖蛋白（ZP）与精子特异结合为先决条件的，人类存在着四种ZP，分别作为起始与次级受体与精子以配体-受体方式特异性结合，诱发顶体反应等生理功能。本研究将利用ZP与精子特异性识别结合的生物学特性，重组克隆四种ZP基因并进行过表达；纯化含载体标签与ZP的融合蛋白，或酶解后纯化ZP蛋白；融合的与单纯的ZP与精子及不同条件下保存的混合斑中精子进行结合试验；抗标签抗体、吸附生物素化ZP的链霉亲和素或抗ZP抗体交联的琼脂糖珠特异地结合融合蛋白或ZP蛋白，分离纯化精子；得到的精子进行DNA多态性标记分析。同时也将该方法应用于法医学实际案例中。该方法的准确实施将为法医学混合斑中精子细胞分离开拓一个新思路。

精子细胞和卵细胞的结合具有高度亲和性和特异性，包绕卵细胞膜外的卵膜糖蛋白（ZP）在与精子细胞的结合中发挥着重要作用。人类存在ZP1-ZP4四种不同的卵膜糖蛋白，体内外研究显示四种ZP在与精子细胞结合的过程中扮演者不同角色。生殖学领域对于ZP与精子细胞的相互作用研究主要以卵细胞与获能精子为对象，而对于过表达的ZP与未获能精子细胞结合的研究甚少。在法医物证学领域中，对精子细胞分离后进行个人识别是一项重要内容，而源于性犯罪案件中混合检材中精子细胞的分离鉴定至今仍然是一个极具挑战性的内容。据此，本项目借鉴两个不同学科领域的研究背景而立题，开辟和建立一种新的研究途径。本研究制备了含有人类ZP1-ZP4编码区的原核及真核重组子，也构建了含有与精子细胞结合的ZP短片段重组子；对四种ZP重组子在原核及真核细胞中进行过表达，并对表达产物进行验证；应用HIS标签对过表达ZP蛋白进行分离、纯化；借助ELISA和免疫荧光法检测不同ZP蛋白与单纯精子细胞的结合，并对反应条件进行优化；采用瞬时转染和后续的药物筛选，建立稳定表达ZP蛋白的CHO细胞系，基于该细胞系研究与精子细胞之间的相互作用；利用纯化的ZP蛋白分离混合斑中精子；采用多种分型方法进行DNA遗传多态性分析，并对微量及降解DNA检材进行检测。研究结果显示人类ZP蛋白在原核及真核系统中均呈现高效表达，借助HIS标签分离纯化获得了含有ZP的融合蛋白。原核系统表达的ZP3与精子细胞显示出弱的相互作用，而ZP4未显示结合。真核系统表达的ZP3与精子细胞显示出较强的相互作用，而ZP2则显示出弱的相互作用。建立的稳定表达ZP3部分结构域的CHO细胞显示出与精子细胞的结合。研究建立了多种核基因组及线粒体基因组DNA遗传标记的分型方法，应用HRM法成功对微量及降解DNA检材进行分型。本研究科学意义在于利用生殖学中精卵细胞特异性结合的特性，摸索一条体外卵细胞上的ZP与精细胞显示出高亲和力的方法，继而分离出精子细胞，借助分析DNA多态性达到个人识别的目的。