德国小蠊细胞色素P450氧化还原酶（POR）与P450功能互作的分子机理研究

Cytochrome P450s exist in all the phylogenetic clades of biological world and play important biological roles by catalyzing aerobic oxidation of many endogenous and exogenous substrates, which depends on the electrons provided by cytochrome P450 oxidoreductase (POR). In contrast to the diversity of P450 type, POR with a single copy exists in the genome of insect. So POR is the key rate-limiting factor to P450 activities. The molecular mechanisms that one POR can interact with various P450s have not been clearly characterized so far. This study attempts to predict the key amino acid sites involved in functional interaction between P450-POR in German cockroach by virtue of evolutionary trace analysis and validate the function of key residues by utilizing site-directed mutagenesis and biochemical activity analysis.

细胞色素P450分布于物种进化的各谱系内，通过催化内、外源底物的氧化反应发挥重要生理功能，该反应需要其氧化还原搭档POR提供不可或缺的电子。与P450种类多样性截然不同，POR以单拷贝存在于昆虫基因组，并向不同P450提供电子，成为P450催化活性的限速因子。目前，昆虫体内单一结构的POR分子能与不同P450互作并传递电子的结构机理仍不清楚。为此，本研究以德国小蠊P450酶系为研究对象，通过进化印记分析预测POR分子中与P450发生功能性互作的关键氨基酸位点，并用定点突变与异源活性表达技术验证这些位点构成的柔性表面在二者互作过程中的作用，进而阐明细胞色素P450与POR发生功能互作的分子机理。

细胞色素P450分布于物种进化的各谱系内，通过催化内、外源底物的氧化反应发挥重要生理功能，该反应需要其氧化还原搭档POR提供不可或缺的电子。与P450种类多样性截然不同，POR以单拷贝向不同P450提供电子，成为P450催化活性的限速因子。而昆虫体内单一结构的POR分子与不同P450功能互作的结构机理仍不清楚。为此，本研究以重要卫生害虫德国小蠊为研究对象，以其POR-P450为中心，在阐明POR分子特征、基因功能（in vivo and in vitro）的基础上，通过进化印记等理论分析预测POR分子与P450发生功能互作的关键氨基酸位点（印迹残基），并用定点突变与异源活性表达技术验证这些位点的作用。. 本项目取得如下结果：1）克隆到德国小蠊POR基因（编码678个氨基酸），明确了其以单拷贝存在于基因组，在各发育历期均有不同程度的表达，在成虫触角和马氏管中的表达水平相对较高，其次是中肠，表明其表达丰度可塑性和生物功能多样性；2）德国小蠊POR基因沉默后对溴氰菊酯的敏感性显著增加，表明其参与抗药性形成；首次获得昆虫POR与变态发育表型密切相关的直接证据；3）综合采用计算生物学方法预测了POR分子中参与P450互作的保守性功能残基簇（207D-208D-209D、13D-115E-116E和92E-93E），通过对上述功能残基簇中带负电的天冬氨酸D和谷氨酸E进行突变，导致突变型POR与P450的重组活性显著降低（与野生型POR相比），阐明了POR通过保守印迹残基构成柔性表面的方式实现与不同P450发生功能互作的结构机理。. 总之，本项目研究结果在理论上加深和丰富了我们对POR功能与分子进化模式的理解，在应用中提示以POR分子为靶标（通过RNAi或设计高效抑制剂、增效剂）实现害虫防治与抗性治理，为新型杀虫剂的开发提供思路。