定向进化细胞色素P450 119催化光氧化反应研究

细胞色素P450 119酶是有机合成中具有潜力的生物催化剂候选，是蛋白质工程的理想目标。昂贵复杂的酶辅助因子阻碍了P450 119酶在产业进程中的应用。最近的P450 119酶光氧化反应机理研究提示用便宜易得的氧化剂在紫外光照下产生P450 119活性中间体能实现底物的催化氧化反应，实现从机理研究到实际应用的转化，为辅酶或辅酶再生体系利用问题提供了一条新的解决途径。通过定向进化技术改造P450 119获得高活性的突变酶，是光氧化反应途径下提高酶催化活性，创造新酶活的最有效策略，有助于推动P450 119的生物催化剂产业化进程，具有重要的应用研究价值。本项目拟在光氧化途径下对P450 119酶催化苯乙烯环氧化反应模型进行系统研究，通过定向进化技术构建P450 119突变文库，建立突变文库的高通量筛选方法，获得高活性突变酶，并进一步探索P450 119酶对其它烯烃、脂肪酸以及烷烃底物的新酶活。

CYP 119是第一个被发现的具有热稳定性的细胞色素P450酶，晶体结构已被解析确定，可进行热稳定性修饰，是蛋白质工程的理想目标。通过本项目资助，我们主要完成了以下四个方面的研究工作：1、从源头上培育Sulfolobus acidocaldarius，完成了CYP119基因的提取、克隆和序列测定，完成了酶的表达、纯化和表征，通过我们改进的新制备程序可较高表达量和高纯度获得CYP 119酶；2、熟练掌握了定点突变和定向进化等蛋白结构修饰的技术，通过构建CYP 119突变文库和理性设计以及高通量筛选分析条件的建立和初探，获得了一批具有活性的新突变酶；3、基于P450酶的多途径氧化反应机理，开展了CYP 119酶及其突变酶的热稳定性研究和不对称催化反应研究，发现突变酶能高效提高苯乙烯及其衍生物环氧化反应的催化转化数（最高达577倍）和有效改善反应的对映选择性，首次发现了突变酶催化不饱和脂肪酸底物模型（顺式-beta-甲基苯乙烯）环氧化反应的的对映选择性，为将其开发成为具有特定底物意义的P450环氧化酶生物催化剂提供了重要的参考依据；4、掌握了生物大分子与小分子的分子模拟和分子对接技术，基于明确的晶体结构能有效开展CYP 119酶的构效关系研究，为其它蛋白的结构理性设计和功能改善提供了借鉴。