载脂蛋白A-IV促进胆固醇外流抑制血小板功能的作用及机制研究

Antiplatelet drugs are the baseline treatments for atherothrombosis. However, there is a significant association between high on-treatment platelet reactivity (HTPR) and the clinical outcomes. In the previous studies we demonstrated significantly reduced plasma levels of apolipoprotein A-IV (apoA-IV) in patients with acute coronary syndrome, and in vitro experiments also confirmed that recombinant human apoA-IV significantly inhibited platelet activation and promoted platelet cholesterol efflux. We speculate: apoA-IV can enhance platelet cholesterol efflux, reduce membrane lipid rafts content, attenuate integrin activity, and thus inhibit platelet activation. Based on this, the project intends to in vivo study the influence of apoA-IV deficiency in platelet functions by establishing thrombosis and bleeding models with apoa4 knockout mice, to in vivo investigate the affects of exogenous administration of recombinant human apoA-IV in platelet activation in mice, and to clarify the mechanisms of promoting cholesterol efflux by apoA-IV from platelets through receptor blocking experiments, siRNA interference, immunofluorescence, immunoprecipitation, flow chamber and others. The findings will likely provide a new strategy for antiplatelet therapy , especially HTPR treatment.

抗血小板药物是动脉粥样硬化血栓相关疾病治疗的一线药物。但现有抗血小板治疗存在显著个体差异，治疗中血小板高反应性（HTPR）严重影响患者预后。我们前期研究发现：急性冠脉综合征患者载脂蛋白A-IV(apoA-IV)血浆水平显著降低；体外实验证实重组人apoA-IV能显著抑制血小板活化并促进血小板胆固醇外流。推测：apoA-IV通过增强血小板胆固醇外流，减少血小板膜脂质筏组装影响膜整合素受体活性，抑制血小板活化。基于此，本项目拟利用apoa4-/-小鼠，建立血栓和出血形成模型，在体研究apoA-IV缺失对血小板功能的影响；在体给予重组apoA-IV蛋白，研究升高apoA-IV血浆水平对血小板活化的影响；采用受体阻断、siRNA干扰、免疫荧光、免疫共沉淀、flow chamber等手段研究apoA-IV促进胆固醇外流的作用机制。研究结果将可能为抗血小板治疗尤其是HTPR治疗提供新的策略。

背景及目的.血小板活化在动脉粥样硬化血栓形成中起关键作用。人载脂蛋白A-IV具有控制食物摄入、调节脂质代谢、抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化等作用。研究发现，正常血浆凝血块中鉴定出apoA-IV表达；其基因多态性与食用富含核桃的低脂肉类后发生血栓的风险相关，提示apoA-IV很可能与血小板活化及血栓形成相关。本研究旨在利用重组人apoA-IV，从体外水平和动物模型研究重组人apoA-IV对血小板功能及血栓形成的影响，并探讨其作用的可能机制。.方法.利用重组人apoA-IV体外孵育血小板，观察血小板PAC-1表达及纤维蛋白原结合能力的改变。用纤维蛋白原包被盖玻片模拟静息状态下损伤内膜表面，观察和比较PBS处理组和apoA-IV处理组血小板在包被表面的伸展、片状伪足形成。用流式细胞仪检测apoA-IV对血小板α颗粒释放CD62P的影响。研究不同浓度apoA-IV对不同诱导剂刺激下血小板聚集的作用。体外模拟血流下内皮损伤，观察apoA-IV处理全血与PBS组在血栓形成数量和体积的差异。建立小鼠颈动脉血栓形成模型，经尾静脉注射重组人apoA-IV(20mg/kg)，观察处理组和PBS组血管阻塞时间。利用western blotting检测血小板上ABCA1、ABCG1和SRB1的表达。荧光标记胆固醇，比较apoA-IV与PBS处理组血小板胆固醇外流比例。.结果.重组人apoA-IV显著抑制人血小板PAC-1表达及纤维蛋白原结合；抑制活化血小板在纤维蛋白原表面的伸展、伪足形成；抑制活化血小板释放α颗粒内CD62P；并抑制体外人血小板聚集及能减弱血小板体外成血栓能力。而在小鼠颈动脉血栓模型中未发现体外注射重组人apoA-IV可以延长血管阻塞时间(p > 0.05)。免疫共沉淀未在血小板上鉴定出重组apoA-IV的结合靶点。WB证实血小板膜表面表达ABCG1和SRB1。荧光标记胆固醇行胆固醇外流实验发现，apoA-IV处理的血小板逆向转运的胆固醇量较PBS组显著增加(p < 0.0001)。.结论.重组人apoA-IV抑制体外人血小板活化、黏附、释放和聚集，并减弱血小板体外成血栓能力。机制可能与apoA-IV作为胆固醇受体，接受血小板膜表面ABCG1和SRB1逆向转运的胆固醇、进而改变血小板膜脂质结构有关。这为临床发掘新型有效的抗血小板剂提供理论依据。