米糠多肽介导胆固醇外流的分子机制研究

Phytochemicals with antioxidant actives mediating cholesterol efflux is another mechanism for cholesterol metabolism. To our knowledge, there were no reports about the cholesterol efflux mediating ability of peptides from food scours. The objective of the project is to investigate the effects of rice bran peptides on the cholesterol efflux pathway medicated by the ATP binding cassette transporter A1 (ABCA1). The oxidative modification of apolipoprotein A-I (ApoA-I) and the pathway of peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), liver X receptor α (LXRα), and ABCA1 will be focused on. Cholesterol efflux in macrophage cell line and reverse cholesterol transport in mice will be investigated to demonstrate the efflux mediating ability of rice bran peptides. Meanwhile, the antioxidant activities of rice bran peptides will be studied by analyzing the oxidation state of live and plasma. Furthermore, the mRNA and protein expression levels of antioxidant enzymes, ABCA1 and other related genes will be studied. The molecular mechanism of rice bran peptides medicating the oxidative modification of ApoA-I and the pathway of PPARγ- PPARγ- PPARγ will be explored, which may be related to the up-regulating of antioxidant enzymes expression by rice bran peptides. The research result will present an important theoretical support for the cholesterol lowering mechanism of peptides.

具有抗氧化生物活性的植物化学物质介导胆固醇外流调节胆固醇代谢的分子机制备受关注，食源性多肽介导胆固醇外流的研究尚未见报道。本项目拟以固相合成的、具有降胆固醇及抗氧化活性的米糠多肽为对象，围绕ABCA1介导的胆固醇外流这一代谢途径，以载脂蛋白ApoA-I的氧化修饰和PPARγ-LXRα-ABCA1信号转导通路为切入点，阐明米糠多肽介导胆固醇外流的分子机制。通过巨噬细胞内胆固醇外流的静态表征和胆固醇逆转运的动态表征，揭示米糠多肽介导胆固醇外流的代谢过程；分析机体内组织器官的氧化状态， 探究米糠多肽在机体内的抗氧化应激活性；通过分析内源性抗氧化酶、ABCA1及其相关基因的mRNA及蛋白质表达水平，深刻阐明米糠多肽通过提升内源性抗氧化酶的表达调节ApoA-I的氧化修饰和PPARγ-LXRα-ABCA1信号转导通路的分子机制。研究结果将为进一步阐明食源性多肽的降胆固醇机制提供新的理论支持。

米糠是稻谷加工过程中的副产物，采用碱法提取米糠蛋白，得到脱脂米糠蛋白（defatted rice bran protein，DRBP）、新鲜米糠蛋白（fresh rice bran protein，FRBP）。碱性蛋白酶Alcalase 2.4 L酶解DRBP和FRBP，分别得到脱脂米糠蛋白酶解产物（defatted rice bran protein hydrolysates，DRBPH）、新鲜米糠蛋白酶解产物（fresh rice bran protein hydrolysates，FRBPH）。通过体外抗氧化，胆固醇胶束溶液束缚实验及结构分析探讨样品体外潜在的降胆固醇能力。以喂食高脂高胆固醇饲料的雄性ICR小鼠为动物模型，研究米糠蛋白及其酶解产物调控胆固醇代谢的作用效果。利用实时定量PCR（real time PCR）研究小鼠胆固醇代谢相关基因的表达水平。.结果表明两种蛋白及其酶解产物在一定浓度下，具有不同程度螯合金属离子，清除H2O2、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、羟自由基的能力及对胆固醇胶束溶液的束缚作用。DRBP经酶解后，内源荧光λmax没有发生改变；表面疏水指数、巯基含量显著（P < 0.05）降低72%和30%。FRBP经酶解后，内源荧光λmax向长波长方向移动；表面疏水指数显著降低13%；巯基含量显著（P < 0.05）升高30%。样品Lys/Arg低于大豆蛋白。.体内实验结果表明，新鲜米糠组体重和体重增加量显著（P < 0.05）降低；样品组小鼠血浆中总胆固醇、极低密度脂蛋白（VLDL-C）、甘油三酯含量显著（P < 0.05）降低；新鲜米糠组肝脏总胆固醇含量显著（P < 0.05）降低；两种酶解产物高低剂量组肝脏中甘油三酯的含量显著（P < 0.05）下降34.2%-51.1%；样品组胆汁酸排出量均有不同程度的增加（9.1%-40.7%）。样品对于分解代谢过程中胆固醇7 α-羟化酶（CYP7A1）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、肝细胞核因子（HNF-4α）基因，合成代谢中固醇调节元件结合蛋白2（SREBP2）基因，逆转运过程中三磷酸腺苷结合盒转运蛋白A1（ABCA1）基因及吸收过程的乙酰辅酶A：胆固醇酰基转移酶（ACAT2）基因具有一定的调控作用。ABCA1基因的相对表达量与血浆低密度脂蛋白（LDL-C），VLDL-