膜受体介导雌激素干扰软体动物内分泌发生机制研究

Recent studies showed that the non-genomic mechanism might play a key role on regulating the endocrine in organism exposure to endocrine disrupting chemicals. Based on the transcriptomes of freshwater snail obtained from our recent studies, the present study will perform the enrichment analysis firstly using GO tool to find the differential expression genes relating the reproduction and endocrine. And then, the temporal and spatial expression patterns of the G protein-coupled receptor (GPCR), serotonin receptor (5-HTR), dopamine receptor (DR) and the nuclear receptor (RXR) in the organism will be evaluated using the molecular biology tools. At the same time, their expression patterns in organism exposed to the E2, BPA and TBT will be studied, and the interaction ability between ligand and receptor will be evaluated. Based on the results obtained from the above studies, the proteomics in tissues will be performed and the differential proteins will be analyzed using GO, COG and pathway tools. Combining with the functions of differential expression genes, the present project will gain an insight into the pathways throughout the non-classic membrane receptor in mollusks exposure to estrogens, and this will be helpful to understand the ecological risk for invertebrate exposure to EDCs.

非基因组信号途径在环境内分泌干扰物影响生物内分泌行为中可能起着关键作用。本课题在前期已构建的淡水螺转录组基础上，利用GOEAST软件完成差异表达基因的pathway富集分析，筛选与雌激素暴露、繁殖和内分泌信号途经相关基因；以膜受体包括G蛋白偶联受体、5-羟色胺受体、多巴胺受体以及相关核受体（如RXR-like）为目标，在构建膜受体在淡水螺各组织中的时空表达模式和性别差异表达基础上，深入研究膜受体对典型环境激素的响应模式、膜受体与雌激素的结合能力。在此基础上，利用蛋白质组学技术研究环境激素对螺组织蛋白质水平的影响，结合上述差异基因表达分析结果，筛选和鉴定、分析差异蛋白（GO、COG，pathway），结合环境调查深入探讨环境激素类物质通过膜受体信号途径干扰腹足类软体动物内分泌行为的潜在发生机制，研究结果为全面开展环境内分泌干扰物的生态风险评价奠定理论依据和技术基础。

课题主要围绕环境污染物干扰无脊椎软体动物内分泌系统的分子机制开展相关研究。研究首先开展富营养化水体对淡水纹沼螺个体发育的影响，发现在苏州湾、梅梁湾、贡湖湾和竺山湾现场暴露后雌性纹沼螺发生性畸变，并以梅梁湾的发生率最高（2.90%）。发生的畸变分为一种是在右侧触角后部对应的是雄性交接器的位置具有一个异常凸起，另外一种是在右侧触角后部具有一个交接器形状器官，但没有附属管。经分析同期水体藻毒素水平，认为螺畸变可能与水华藻的暴露有关。因此进一步研究了水华藻分泌物9cis-RA对纹沼螺的毒理效应，并利用高通量测序技术筛选敏感标志物基因。结果发现9cis-RA暴露会导致875基因上调和462个基因下调，并经对差异基因进行富集分析发现主要集中在Cellular Component途径。为揭示环境雌激素干扰纹沼螺的作用机制，首先利用RACE技术扩增了纹沼螺雌激素1784bp全序列，并利用ORFFinder软件确定ORF 编码框1386bp碱基，利用Protparam预测由该阅读框编码蛋白的分子质量计算值为50352.85D。利用BLAST在线比对ER基因编码区蛋白序列，与NCBI数据库中已注册ER基因具有高度相似性，并且位于DBD区的P-box和D-box均与无脊椎动物显出明显的保守性，位于LBD区的AF2也与无脊椎动物也显示出明显的保守性。分子进化树分析发现与无脊椎动物Nucella lapillus和Reishia clavigera表现出较近的亲缘关系。取暴露100ng E2/L和100μg MT/L的24h和72h的雌、雄纹沼螺组织样品，利用PacBio Iso-Seq构建三代测序转录组数据库，同时利用RNA-Seq构建二代转录组数据库。将二代和三代测序数据进行融合分析，得到准确的全长转录本序列，最终得到可作为二代数据的参考转录本序列的非冗余isoform集合共计216,598条序列。经NR、GO、KEGG等功能注释，共计118,842条序列注释到NR数据库，64,657条序列注释到GO功能，另有44.97%序列没有得到注释。进一步筛选出注释为GPER序列，利用RACE技术扩增该基因全序列，并利用定量PCR对雌激素暴露下纹沼螺ER、ERR和GPER等基因表达模式，证实雌激素等外源物质同时通过ER、ERR和GPER等膜受体和核受体途径影响软体动物内分泌行为。