肝癌细胞靶向性药物与miR-122共传输体系及其协同抗肿瘤作用机制研究

Multiple drug resistance (MDR) can lead to hepatocellular carcinoma cells (HCC) resistance to chemotherapy. Using miRNA to regulate the expression of resistance and apoptosis related genes and enhance chemotherapeutic sensitivity in cancer cells is one of the current research hotspots. In our previous work, we addressed that miR-122 can improve sensitivity of HCC to 5-FU by regulation of the hepatic multidrug resistance gene expression. According to that, drug and miR-122 co-delivered by the HCC-targeting system is constructed. Then it can transfer 5-FU and miR-122 to HCC, reduce toxicity of 5-FU, and show a synergistic anti-tumor effect. Therefore, we intend to synthesize macromolecular prodrug GC-FUA by directly couple 5-FU to GC, then load miR-122. Both in vivo and in vitro experiments will be performed to clarify the mechanism of synergistic anti-tumor effect. One is the miR-122 and 5-FU would be transferred to HCC by miR-122/ GC-FUA nanosystems, the other is miR-122 would retard the cell cycle, induce apoptosis and inhibit cell proliferation and invasion by regulating the expression of MDR1, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, wtp53 and other related genes. The project about this new drug and gene co-delivery will provide a new approach to targeted cancer therapy.

MDR导致肝癌化疗效果不佳。利用miRNA调控肿瘤耐药及凋亡相关基因，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性已成为当前研究热点。以课题组前期发现的"人肝脏特异性miR-122通过调控肝癌耐药细胞基因的表达，增强人肝癌耐药细胞对5-FU敏感性"为切入点，构建肝癌细胞靶向性miR-122/GC-FUA纳米体系，该体系将5-FU与miR-122共传输至肝癌细胞，发挥协同抗肿瘤效果，并降低5-FU毒副作用。为此，本项目将5-FU直接偶联到GC上制备大分子前药GC-FUA，并采用GC-FUA包装miR-122。开展体内外实验，证实该纳米体系将miR-122与5-FU共传输至肝癌细胞，揭示miR-122通过调控MDR1、Bcl- 2、Bcl-xL 、Bcl-w和wtp53等基因的表达，阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡，抑制侵袭性增殖，发挥协同抗肿瘤作用的机制。本项目将为药物与基因共传递体系用于肿瘤靶向治疗开辟思路。

本项目充分考虑化疗药物临床缺陷，结合肝癌靶向治疗、协同治疗优势。设计、合成大分子前药半乳糖化壳聚糖-氟尿嘧啶偶合物GC-FUA，制备并表征半乳糖化壳聚糖-氟尿嘧啶（GC-FUA）纳米体系，并研究其体外抗肝癌作用及靶向性机制，以及在SD大鼠体内药代动力学、组织分布情况等。进一步采用GC-FUA大分子前药GC-FUA作为肝脏特异性基因药物miR-122载体，成功制备出肝癌靶向性5-FU与miR-122共传输纳米体系；探讨GC-FUA/miR-122共传输体系的细胞相容性、血液相容性和对SD大鼠器官损伤等生物相容性情况；研究体外抗肿瘤效果及靶向性评价，GC-FUA/miR-122共传输体系对肝癌细胞凋亡情况及迁移和侵袭能力检测，检测miR-122相关靶蛋白Bcl-2、ADAM17的表达；建立荷瘤裸鼠肝癌移植瘤模型，宏观评价其体内抗肿瘤效果及毒副作用，微观进行肿瘤采样染色和免疫组化分析，进行体内组织分布情况研究等。结果表明：1）成功合成大分子前药GC-FUA，并制备出GC-FUA纳米体系，且具有良好的生物相容性，验证GC-FUA通过去唾液酸糖蛋白受体介导肝癌细胞HepG2内吞靶向机制；2）GC-FUA纳米体系具有一定的长循环作用，可延长化疗药物5-FU的生物半衰期；3）大分子前药GC-FUA成功转染miR-122，可用作基因药物载体；4）GC-FUA/miR-122纳米体系生物相容性良好，可用于静脉注射给药；5）GC-FUA/miR-122可以下调Bcl-2、ADAM17的表达，显著抑制肝癌细胞的迁移和侵袭，对肝癌的转移意义重大；5）具有一定的肝脏组织和肝癌细胞靶向性，对其他重要脏器毒副作用小；6）显著抑制肿瘤的生长，具有明显的体内、外抗肝癌效果。因此，本项目已基本完成了研究内容，证实GC-FUA/miR-122纳米体系是一种安全、高效、具有肝癌靶向性的基因与药物共传输体系，并阐明GC-FUA/miR-122纳米体系通过miR-122调控耐药相关基因表达，增强5-FU诱导耐药肝癌细胞凋亡，阻滞细胞周期，抑制侵袭性增殖，发挥协同抗肿瘤作用。有效地解决了不同抗肿瘤作用机制的药物共传递的问题，为肝癌的多药联合治疗的临床应用提供了科学基础。