基于“扶正祛邪”理论研究益肾散结中药调控MSCs外泌体修复肾纤维化的作用及机制

MSCs is a hot scientific focal point in the field of renal fibrosis (RF) through the paracrine mechanisms of repairing tissue damage. Some studies revealed that the progress of RF is close related to the activation of TGF-β1/Smad signaling pathway by the kidney miR-196, while the MSCs-exosome has the function of miR-196 secretion. The Yishen Sanjie herb have the effect of promoting the MSCs secreting cytokines, regulating the expression of fibrotic proteins, and inhibiting the progression of RF based on the theory of “fuzhengquxie”. The herb also has the effects of invigorating shenqi and activating blood and dissipating stagnation to improve the renal microenvironment. In a word, we speculate that Yishen Sanjie herb may adjust the secretion of miR-196 by MSCs-exosome through the way of invigorating shenqi and regulating the expression of TGF-β1/Smad signaling pathway and repaired RF through the way of activating blood and dissipating stagnation.This project apply the techiques of cell culture, miRNA analysis, and plasmid transfection techniques from the aspect of in vitro and in vivo to study the regulatory effect of Yishen Sanjie herb for the exosome of MSCs on miR-196 excretion and TGF-β1/Smad signaling pathways, providing experimental basis for the mechanism of Yishen Sanjie herb regulating RF treatment by MSCs-exosome. We hope that a new method of the RF treatment can be explored in the future.

MSCs通过旁分泌机制修复组织损伤是肾纤维化(RF)领域研究的热点科学问题。研究发现，RF的进展与肾脏miR-196激活TGF-ß1/Smad信号通路有关，而MSCs外泌体有分泌miR-196的作用。研究证实，以“扶正祛邪”理论立法组方的益肾散结中药具有促进MSCs分泌细胞因子，调节纤维化蛋白表达，抑制RF进展的作用。也具有补益肾气，活血散结改善肾脏微环境的功效。因此，我们推测益肾散结中药可能通过补益肾气以扶正来调节MSCs外泌体分泌miR-196，活血散结以祛邪来调控TGF-ß1/Smad信号通路表达，完成RF修复。本项目从在体和离体方面，应用细胞共培养、miRNA分析和质粒转染等技术，研究益肾散结中药对MSCs外泌体miR-196的分泌作用及其对TGF-ß1/Smad信号通路的调控作用，为益肾散结中药调控MSCs外泌体治疗RF的机制研究提供实验依据，冀将来能探索出一种治疗RF的新方法。

近年来，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）通过旁分泌机制修复组织损伤是肾纤维化研究的热点科学问题。MSCs外泌体（MSCs-exosome）具有将细胞核产生的遗传信息[主要是微RNA(micro RNA,mi RNA）]通过各种蛋白质和脂质载体运输到靶细胞的细胞间通讯信息交流作用。我科研制的以“扶正祛邪”理论立法组方益肾散结中药肾复康2号具有促进MSCs分泌细胞因子，调节纤维化蛋白表达，抑制肾纤维化进展的作用。因此，我们提出“益肾散结中药调节MSCs外泌体生存微环境，通过补益肾气以扶正来调节MSCs-exosome分泌microRNA，活血散结以祛邪来调控TGF-β1/Smad信号通路的表达，从而完成肾纤维化修复”的假说。为了验证假说，我们开展了肾康复II号与肾纤维化相关靶点的生物信息学分析、肾康复II号外泌体相关miRNA的ceRNA网络，关键miRNA调节TGFβR2和COL1及TGF-β1/Smad信号通路调控肾纤维化水平、益肾散结中药对MSCs-exosome分泌肾纤维化相关蛋白及microRNA影响的系列实验研究。我们采用体外细胞培养方法，经Western Blot、流式细胞仪、电镜、NTA等方法鉴定，证实提取的类圆形或圆形囊泡为MSCs-EXO。研究结果表明，肾康复II号在肾纤维化过程中发挥关键作用靶点为可能为PI3K-Akt、TGF-β1/.Smad2、NF-kB通路。生物信息学分析和体外实验证明，肾复康II号作用的MSCs-exosome中，分泌的miR-21-5p具有抑制纤维化进展的作用。益肾散结法及其制剂-肾复康Ⅱ号胶囊可以抑制MSCs-exosome分泌PI3K、Smad2、AKT、NF-kB、TGF-β1蛋白的表达，具有抗肾脏间质纤维化发生的作用，其机制可能是通过抑制miR-21-5p的表达而发挥作用的。该课题已经完成了项目申请书中的全部研究内容。目前发表学术论文5篇，相关研究获得陕西省科技进步三等奖1项，培养硕士研究生4名。本研究证明基于“扶正祛邪”理论立法组方的益肾散结中药通过调节肾脏微环境，促进MSCs外泌体分泌miR-21-5p，进而调控TGF-ß1/Smad2信号通路表达，完成肾纤维化的修复。本研究为益肾散结中药调控MSCs外泌体治疗肾纤维化的机制提供实验依据，为探讨治疗肾纤维化的新方法奠定基础。