哈维氏弧菌进入活的非可培养状态过程相关基因及作用

病原菌在不良环境中形成活的非可培养（VBNC）状态，进入VBNC状态的细菌有可能恢复为可培养形式，并恢复其致病力。哈维氏弧菌是引起我国海水养殖动物疾病的重要的病原菌。我们发现哈维氏弧菌在低温和寡营养海水中能形成VBNC状态。本项目拟用DNA芯片杂交技术和蛋白质组技术筛选哈维氏弧菌在非可培养状态时特异性表达蛋白和转录基因，克隆这些特异性蛋白基因后连接到选择性自杀质粒，用接合重组技术构建特异性基因的缺失突变株。研究突变株在正常状态和VBNC状态时的生物学特性和致病力。研究特异性基因在形成非可培养状态过程中的作用；利用实时荧光定量PCR研究哈维氏弧菌在低温条件下诱导培养不同时段这些基因的转录特征，进一步研究哈维氏弧菌生存能力与特异性基因表达的关系。为探索哈维氏弧菌病原在自然环境中的生存和疾病的发生机制提供理论依据，并为防治哈维氏弧菌病发掘新的的高效抗原和药物作用靶点。

哈维氏弧菌是水产养殖动物重要病原菌。本项目主要研究了哈维氏弧菌在进入活的非可培养状态过程特征和相关基因及其表达。将哈维氏弧菌不同菌株在低温诱导培养，在第65-69天进入活的非可培养状态。电镜下观察细胞变成球形，个体缩小，细胞周质空间明显变大，但细胞仍保持着结构完整性。用蛋白质组学方法研究表明 VBNC状态时有30个新表达蛋白质，有34个蛋白质停止表达。表达量差异在3倍以上的蛋白质33个，有20个蛋白质表达量增加，13个蛋白质表达量减少。用表达芯片技术研究发现哈维氏弧菌VBNC状态细胞差异表达基因693个，复苏状态细胞差异表达基因973个。包括细胞转录、凋亡、信号转导、中间代谢、氨基酸代谢和蛋白质合成代谢等与细胞活动密切相关的各种基因。添加复合维生素B或吐温20和酵母液能使哈维氏弧菌复苏，细胞恢复正常形态，对紫外辐射，热激抵抗能力没有明显改变，对高渗透压抵抗力减弱，而对冷激的抵抗力增强。复苏后哈维氏弧菌恢复了致病性。从哈维氏弧菌基因组克隆了部分与细菌环境应激及毒力相关的基因。包括硫氧还蛋白还原酶基因、超氧化物歧化酶基因、寡肽结合蛋白基因，细胞复苏促进因子样蛋白基因。表达的硫氧还蛋白还原酶分子量为34 kDa。SOD的分子量为27 kDa，细胞复苏促进因子样蛋白分子量约为27 kDa。寡肽结合蛋白分子量大小为58 kDa左右。利用同源重组方法构建了哈维氏弧菌寡肽结合蛋白基因突变株，突变株致病性毒性降低。. 用荧光定量PCR对哈维氏弧菌VBNC状态形成过程中部分环境应激和毒力相关基因表达水平进行动态检测。发现在低温诱导前期rpoS、cysS和vhh 基因表达量均比正常状态增加，随着低温诱导时间的延长，3种基因的表达量逐渐减少，进入VBNC状态后rpoS、cysS和vhh基因的表达量分别下降为原来的0.037倍、0.055倍和0.232倍，复苏后rpoS基因表达量约为正常状态时的0.674倍，cysS基因和vhh基因表达量则均恢复到正常水平。hsp、oppA和MnSOD基因表达量在低温诱导过程及进入VBNC状态后均呈下降趋势，复苏后这三种基因的表达量分别为正常时期的1.765倍、0.232倍和2.593倍。进入VBNC状态时毒力相关基因表达量降低，复苏后恢复到正常水平，可能是哈维氏弧菌复苏后保持致病性的重要原因之一。