基于组学的副溶血弧菌“活的非可培养状态”的分子机理研究

Vibrio parahaemolyticus is a major food-borne pathogen. Studies show that some bacteria can enter viable but nonculturable (VBNC) state, maintaining survival under the stresses of environmental conditions. This is the potential threat to food safety. However, the molecular mechanisms for V. parahaemolyticus to enter the VBNC state under the adverse environmental conditions occurred during the food preservation are poorly understood, and the exsiting methods for detecting VBNC V. parahaemolyticus have their defects. In this study, the combined use of transcriptomics, protemics and bioinformatics methods was carried out to investigate the above-mentioned underlying molecular mechanisms. Physiological and metabolic features, proteome, and transcriptome of VBNC V. parahaemolyticus will be characterized, and the functional signature molecules of VBNC V. parahaemolyticus will be identified. In addition, the PMA-LAMP method will be established for detecting the VBNC V. parahaemolyticus. This study will contribure to the deeeper understanding of the survival mechanisms of food-borne pathogens under stressful environmental conditions, and provide theoretical basis and technical supports for the prevention and control of food-borne pathogens in the VBNC state.

副溶血弧菌是引起食源性疾病的首要病原菌，研究证实不利环境可使某些细菌进入活的非可培养状态（Viable But Nonculturable State,VBNC)，成为食品安全的潜在威胁。目前对副溶血弧菌在不利环境因素胁迫下以VBNC状态存活的分子机制的认识还很缺乏，现有的检测方法也有诸多缺陷。本项目综合运用转录组学、蛋白组学和生物信息学的手段，对其潜在的分子机理进行系统深入的研究，解析状态转变中的细胞物质基础及代谢特征，构建差异蛋白质谱和差异基因表达谱，筛选调控VBNC的功能分子标志物，以阐明VBNC细菌在不良环境条件下应激存活的内在机制；并研建VBNC副溶血弧菌的PMA-LAMP快速检测体系。本项目的完成有助于深入了解副溶血弧菌及其他食源性致病菌耐受不良环境胁迫的机理，对及时有效控制食品保藏条件，消除食源性致病菌残留的食品安全隐患提供重要的理论依据与技术支持。

副溶血弧菌是重要的食源性致病菌，在不利条件下可进入活的非可培养态（VBNC)，成为食品安全的潜在威胁。本项目考察不同环境因素胁迫对副溶血弧菌进入VBNC的影响；对VBNC和复苏后的应激生理特性和分子调节机制进行深入研究，在蛋白组和转录组水平上，构建差异蛋白质谱和基因表达谱，并进行功能注释，以阐明VBNC菌在不良环境条件下应激存活的内在机制；并研建快速定量检测VBNC菌的PMA-LAMP和PMA-qPCR技术。主要结果：1）副溶血弧菌在寡营养，不同温度、pH、渗透压、山梨酸钾和氯霉素作用的一定条件下，皆可进入VBNC。2）以荧光显微镜、扫描和透射电镜及流式细胞仪对VBNC态、正常态及复苏态的菌体进行观察，并采用HPLC测肽聚糖含量及组成，分析细胞壁抗性，明晰了其生理特性的差异。3）采用不同方法对VBNC菌进行复苏，并分析复苏后的生化特性，考察冷激、热激、紫外线照射、醋酸、山梨酸钾和微波处理下的应激特性，复苏菌对酸、紫外线照射、微波处理的抗性强于正常菌。4）研建PMA-LAMP和PMA-qPCR快速检测技术，设计特异性引物，优化反应条件，确定PMA作用剂量及曝光时间，建立的荧光定量LAMP和qPCR法的特异性强、灵敏度高，最低检测限为6.8 CFU/mL和102CFU/mL，并具良好的线性关系。5）以蛋白组学方法鉴定了VBNC的显著差异蛋白51个，对其进行功能注释，GO分析表明差异蛋白主要参与翻译、鞭毛组成等生物过程；主要分布在核糖体、细菌鞭毛上；分子功能上具有核糖体的结构、rRNA结合、含铁细胞跨膜运输等功能。6）对防腐剂、低温诱导的VBNC的差异表达基因进行分析，鉴定了上调基因721个，下调基因891个；GO分析和KEGG分析明晰了其功能和代谢通路。7）对寡营养、低温诱导的VBNC的差异表达基因进行分析，鉴定了显著下调基因572个、上调基因428个；并进行GO 和KEGG 通路分析。8）对复苏后菌的差异表达基因进行分析，与VBNC比较显著上调基因432个，下调基因462个；与正常态比较显著上调基因67个，下调基因55个。并进行GO 和KEGG 分析。9）分析副溶血弧菌VBNC态与生物膜的形成规律，结果表明VBNC态时生物膜形成量低。浮游菌比生物膜菌更易诱导进入VBNC态。本项目完成有助于深入了解副溶血弧菌耐受不良环境胁迫的机理，对及时有效控制副溶血弧菌奠定理论基础。