血根碱在猪的还原代谢及关键代谢酶研究

Sanguinarine is a natural benzo[c]phenanthridine alkaloid and has antimicrobial, antitumor, growth-promoting and antiplatelet activities, which are worth applying it to veterinary medicine. Previous studies demonstrated that the reduction of sanguinarine is a major detoxification pathway in animals. However, the mechanism of reduced metabolic enzymes involved in sanguinarine is still poorly understand. Based on our early studies, the detoxifying enzymes involved in the reduction of sanguinarine may be NAD (P) H quinone oxidoreductase (NQO1) and NRH quinone oxidoreductase (NQO2). And sanguinarine could be metabolized by intestinal metabolism system. Therefore, multiple technologies, which include real-time quantitative PCR, western blot, siRNA interference, protein overexpression and analytical chemistry, will be used to study. The aim of the study is to determine the oxidoreductase involved in sanguinarine reduction. In addition, the detoxification mechanism of sanguinarine will be clarified by the quinone oxidoreductases signal pathway. We also screen some medicinal plants monomer functional ingredients to prevent the toxicity of sanguinarine. The metabolism of sanguinarine by intestinal metabolism system will also be studied to explain metabolic mechanism. Besides, metabolism of sanguinarine in swine will give scientific guidance for the identification of metabolic locations．The results will give scientific guidance for the clinical use and reducing toxicity of sanguinarine. Moreover, the study will contribute valuable information for the food animal safety assessment of sanguinarine.

血根碱是一种天然的苯菲啶类生物碱，具有抗菌、抗肿瘤、促进动物生长及杀虫等作用，在兽医领域具有开发前景。国内外研究证明血根碱的还原代谢是体内的一条主要代谢途径，然而，催化其还原的代谢酶至今尚未深入研究，课题组的前期研究表明，血根碱的还原代谢与NAD(P)H醌氧化还原酶（NQO1）和NRH醌氧化还原酶（NQO2）有关，同时发现血根碱在肠道代谢体系中亦能被代谢，因此，本课题将采用实时荧光定量PCR，蛋白印迹，siRNA干扰，蛋白过表达和分析化学等多种技术和手段，确定醌氧化还原酶参与血根碱的还原代谢，揭示醌氧化还原酶信号通路降低血根碱毒性的作用机制，并筛选出降低其毒性的药用植物单体功能成分，同时，研究血根碱在猪肠道的代谢，阐释其肠道还原代谢规律，以及进行体内代谢研究，阐明它在体内的生物转化和可能的代谢部位，为其临床合理用药和降低毒性提供科学依据，亦为应用于食品动物的安全性评价提供理论参考。

血根碱具有抗菌、抗肿瘤、促进动物生长及杀虫等作用，在兽医领域具有开发前景。为研究其被还原代谢成毒性较低的二氢血根碱的代谢酶与机制，通过建立体外代谢系统发现猪心、肝、肾微粒体与胞液、肠道内容物能直接将血根碱还原为二氢血根碱，但NAD（P）H却能显著增强猪微粒体、胞液、肠粘膜匀浆液的还原能力。抑制剂试验表明，猪微粒体、胞液中还原血根碱为二氢血根碱的主要为NQO1、NQO2、羰基还原酶。且血根碱能被重组表达的NQO1、NQO2还原成二氢血根碱。在猪肝微粒体、肝胞液、肠微粒体、回肠内容物中鉴定出血根碱的7种代谢产物，二氢血根碱是肝微粒体中的主要代谢产物和肝胞液、回肠内容物中的唯一代谢产物。. 血根碱可浓度依赖性抑制猪PK15细胞的生长，能下调PK15 NQO1、NQO2、Nrf2 mRNA的表达。NQO1、NQO2 shRNA干扰载体均能下调PK15细胞NQO1 mRNA的表达，且增强血根碱引起的细胞凋亡。NQO1的过表达可降低血根碱对PK15细胞的毒性，并筛选到白藜芦醇能够减小血根碱的毒性。血根碱能引起PK15细胞自噬的发生，引起自噬基因LC3B和BECN1的升高；同时NQO1过表达和低表达均引起自噬现象增加，以及LC3B和BECN1的表达升高。血根碱还能引起细胞凋亡的发生，NQO1过表达和低表达均能减轻血根碱引起的细胞凋亡程度。. 血根碱小鼠灌胃给药的LD50为1029.7mg/kg，大鼠以21 mg/(kg·d)给药30d时，谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平升高，其他指标正常。以1mg/Kg体重给猪灌胃血根碱24h后，在各脏器未检测到血根碱及其代谢物，在粪便、尿液中分别检测到5、2种代谢物，各组织的残留结果表明血根碱的吸收率低，主要通过肠道排出，且在各组织的残留很低。. 综上所述，本课题发现将血根碱转变为的二氢血根碱的3条代谢途径，即通过NAD（P）H进行非酶还原；酶促还原；在肠道内容物中发生氢化还原。并采用分子生物学方法与技术确定醌氧化还原酶参与血根碱的还原代谢，揭示其降低血根碱毒性的机制，并筛选出降低其毒性的白藜芦醇，同时在猪的体内代谢研究为其临床合理用药、安全性评价提供实验依据。