黄曲霉毒素在猪体内代谢的关键细胞色素P450氧化酶的筛选、确定及催化机制研究

黄曲霉毒素B1（AFB1）具有强烈的毒性和致癌、致畸、致突变性，是迄今发现的污染农产品毒性最强的一类生物毒素。AFB1在体内由肝脏细胞色素P450氧化酶活化，产生高毒代谢物：黄曲霉毒素-8，9-外环氧化物（AFBO）。AFBO在畜禽产品的残留极大的危害动物及人类健康。猪作为国内养殖量与消费量最大的畜类动物，对其体内AFB1的代谢机制了解并不清楚。本项目首先利用Taqman探针法并结合蛋白质工程技术，筛选确定猪体内与黄曲霉毒素代谢密切相关的P450酶亚型；然后利用原核表达系统体外重组表达纯化筛选确定的关键P450酶亚型；建立重组关键P450蛋白与AFB1的体外代谢体系，深入探讨猪体内关键P450酶亚型对黄曲霉毒素的代谢机制。本项目同时研究姜黄素、黄酮类、绿茶提取物三种天然产物对P450代谢黄曲霉毒素的活性影响，探讨它们对AFB1在体内代谢的解毒机制，为筛选一种天然饲料添加剂提供理论基础。

本项目主要完成了猪黄曲霉毒素醛还原酶对黄曲霉毒素B1-二醛的底物专一性研究。课题组首先从猪肝cDNA文库中克隆并表达纯化了猪黄曲霉毒素醛还原酶。体外进行猪黄曲霉毒素醛还原酶与AFB1-二醛的孵育检验其活性。高效液相色谱和液质联用技术证明该酶可将AFB1-二醛转化为AFB1-二醇。为进一步探究该酶对不同底物特别是对AFB1-二醛识别并结合的机制，利用定点突变技术我们表达并纯化了M86A, W119A, W266A，E120F和A152F五个突变体。利用HPLC比较它们与野生型对AFB1-二醛的代谢活性。结果发现266位Trp突变为Ala后，酶对AFB1-二醛的代谢活性几乎完全丧失，类似的是119位Trp突变为Ala后，活性降低了约30%；而Met-86突变为Ala后，酶的活性相比野生型提高了60%；E120F和 A152FF的活性均有所增强。为解释这些结果，我们首先根据小鼠7A5的晶体结构通过同源建模得到猪黄曲霉毒素醛还原酶的三维空间结构。然后利用分子对接工具AutoDock4.2，我们进行了AFB1-二醛与猪黄曲霉毒素醛还原酶及其突变体的对子对接研究。结果显示， Trp266的吲哚环侧链与AFB1-二醛分子的香豆素环之间的疏水相互作用对于AFB1-二醛在活性中心的结合发挥关键作用。因此Trp266对于选择性识别和结合AFB1-二醛起决定性作用。类似的是，突变体E120F，A152F和E120F/A152F对二醛活性提高的原因也是因为疏水作用的增强进一步稳定了二醛的结合。而M86A活性的增强则是因为Met86侧链空间位阻的消失，使Trp266更靠近AFB1-二醛，这时Trp266的吲哚环与AFB1-二醛的香豆素环形成pi-pi堆积作用。这种作用加强了AFB1-二醛的结合。稳态动力学研究表明，Met-86和Trp-119对AKR7A家族的一种模式底物2-羧基苯甲醛的结合发挥重要作用，而Trp266则与2-羧基苯甲醛的结合无关。这些结果说明猪黄曲霉毒素醛还原酶的氨基酸对不同底物的识别作用是相对的。. 以上研究结果以第一作者身份发表在国际学术期刊“Biochemical Pharmacology”上。综上所述，本项目按照预期的研究计划取得较好研究成果，完成了预期研究目标，并未后续研究奠定坚实基础。