益气活血解毒方通过AF-SMC间缝隙连接通道抑制成纤维细胞对平滑肌细胞活化的研究

在血管重构研究中，外膜和中膜的相互作用一直是研究的盲点，基于前期研究，益气活血解毒方能减少血管损伤后新生内膜增生，抑制成纤维细胞活化迁移和分泌，抑制外膜炎症。本研究采用球囊损伤颈动脉模型，观察外膜炎症及缝隙连接蛋白的变化。采用成纤维细胞（AF)和平滑肌细胞(SMC)共培养模型，从AF对SMC作用的角度观察： AF被脂多糖活化后分泌活性物质的变化；AF与SMC间缝隙连接的结构和功能以及缝隙连接蛋白Cx43和mRNA的变化；沉默Cx43 RNA对缝隙连接的影响；AF对SMC活化增殖迁移的影响；以探讨AF通过AF-SMC间缝隙连接活化SMC的作用；阐明益气活血解毒方抑制炎性介质活化AF和抑制AF-SMC间的缝隙连接通道的机制。首次用中医外科创伤修复的思路治疗心血管疾病，创造性研究AF与SMC间缝隙连接的作用，为中医药防治再狭窄、高血压、动脉粥样硬化等血管重构性疾病开辟了新思路治疗新手段。

血管重构是PCI后再狭窄、高血压、动脉粥样硬化等疾病共同的病理机制，中膜平滑肌细胞(SMC)和外膜成纤维细胞（AF)分别通过活化迁移和分泌参与血管重构的形成，然而当AF穿过中膜进入新生内膜时，是否对SMC产生作用并影响血管重构呢？本研究采用球囊损伤大鼠颈动脉模型、AF和SMC共培养等方法，观察血管重构、炎症反应、缝隙连接、AF对SMC活化和分泌的影响以及中药益气活血解毒方的干预作用。.结果表明，球囊损伤后7天，颈总动脉内膜轻度增生，而外膜的厚度和面积均明显增加，以正性重构为主；28天时，内膜明显增生，狭窄率为23%，外膜增厚已消失，以负性重构为主。血管损伤后7天，MCP-1、CD68和Cx43蛋白的表达在血管壁内、中、外膜各层均增加，尤其以外膜增加最为显著，且浓度远高于中膜和内膜；益气活血解毒组可明显减少内膜增生；减少巨噬细胞浸润(CD68)，下调Cx43阳性表达面积，但降低MCP-1的作用并不明显。.电镜发现，球囊损伤血管内膜后，外膜成纤维细胞活化为纤维母细胞，胞内有大量粗面内质网和线粒体，可见到活化的纤维母细胞穿过外弹力板向中膜穿行的瞬间，迁移到中膜的纤维母细胞转变成了肌纤维母细胞。模型组中膜的缝隙连接明显增加，其发生于活化的平滑肌之间，肌纤维母细胞与活化的平滑肌细胞也形成了大量缝隙连接。电镜观察体外培养的细胞，在直接接触共培养的AF和SMC之间，可看到缝隙连接结构，但AF和SMC在PET膜上不能形成缝隙连接。.炎性介质酵母多糖和脂多糖明显促进体外培养的AF增殖；LPS可明显刺激AF分泌细胞因子MCP-1、IL-6；活化后的AF明显促进SMC的活化以及MCP-1、TIMP-1和Cx43蛋白的表达增加。中药主要成分/组分黄芪多糖、丹参素、绿原酸均可显著地抑制细胞增殖，减少SMC 中MCP-1、TIMP-1和Cx43的表达。 .本研究表明，AF和SMC在血管重构中并非孤立的，在机械损伤和炎症反应可刺激AF活化，AF活化后通过释放炎症因子和与SMC间形成的缝隙连接，促进SMC活化和释放炎症因子，促进血管重构的发生。益气活血解毒方通过抑制外膜和AF的增殖，减少对SMC的活化、炎症因子释放和缝隙连接蛋白的表达，从而防止血管重构。本研究阐明了血管重构新的病理机制，为中医药防治该病提供了新的思路和治疗手段。