配体-RAGE轴介导的信号通路在严重腹腔感染中的机制研究及其功能调控

Complicated intra-abdominal infection and related sepsis are very dangerous diseases with rapid progress and poor prognosis, which bring great difficulties for clinical treatment work. How to reduce the release out of control of cytokines and mediators of inflammation is of great significance. Previous studies have shown that the receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) is regarded as a prototypic multiligand damage-associated molecular patterns (DAMPs) receptor. And signal pathway mediated by multiligands-RAGE axis often results in fast, continuous cell activation and downstream gene transcription. Inflammation responses are maintained and amplified through NF-κB continuous activation. We hypothesized that, intervention of signal pathway mediated by multiligands-RAGE axis maybe block the activation of cytokines and mediators of inflammation in the downstream of RAGE. Based on the viral vector mediated gene expression system which has been been established in our previous studies, using the technology of RNA interference, western blot, EMSA, hemodynamic monitor et al, this study plans to silent the RAGE gene expression, combined with sepsis animal model in rats caused by severe abdominal infection, illustrate the influencing mechanism of signal pathway mediated by ligands-RAGE axis on inflammatory response, and further discuss the possible way of functional regulation. This study can provide the new theoretical foundation and experimental basis for clinical treatments of complicated intra-abdominal infection and related sepsis.

严重腹腔感染及其相关脓毒症病情凶险、进展迅速，给临床救治工作带来极大困难。如何减少大量细胞因子和炎症介质的失控性释放具有重要意义。既往研究发现，晚期糖基化终末产物受体(RAGE)是一种专性的多配体的损伤相关分子模式(DAMPs)受体，配体-RAGE轴介导的信号通路常导致快速持续的炎症细胞活化和下游基因转录，并通过NF-κB持久活化维持和扩大炎症反应。我们推测，干预配体-RAGE轴介导的细胞内信号通路， 可以阻断RAGE下游途径各种炎症因子、炎性介质的激活。本研究拟在已建立的病毒载体介导的基因表达体系基础上，采用RNA干扰、免疫印迹、EMSA、血流动力学监测等技术，沉默RAGE基因表达，并结合严重腹腔感染导致的脓毒症大鼠动物模型，以阐明配体-RAGE轴介导的信号通路对炎症反应的影响机制，并深入探讨其可能的功能调控方式。研究结果可望为临床严重腹腔感染和脓毒症的治疗提供新的理论基础和实验依据。

严重腹腔感染及其相关脓毒症病情凶险、进展迅速，给临床救治工作带来极大困难。如何减少大量细胞因子和炎症介质的失控性释放具有重要意义。既往研究发现，晚期糖基化终末产物受体(RAGE)是一种专性的多配体的损伤相关分子模式(DAMPs)受体，配体-RAGE轴介导的信号通路常导致快速持续的炎症细胞活化和下游基因转录，并通过NF-κB持久活化维持和扩大炎症反应。我们推测，干预配体-RAGE轴介导的细胞内信号通路，可以阻断RAGE下游途径各种炎症因子、炎性介质的激活，从而达到对严重腹腔感染导致的脓毒症大鼠组织、细胞的保护作用。本研究取得的重要结果包括：（1）成功构建靶向RAGE基因的siRNA真核表达重组质粒Psilencer2.1-RAGE，将其转染永生化鼠巨噬细胞系RAW264.7，并筛选出稳定转染且RAGE基因抑制率高的细胞株。（2）革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）刺激后巨噬细胞分泌炎症因子含量、RAGE基因及蛋白表达、NF-κB活性、磷酸化激酶含量均升高，而Psilencer2.1-RAGE转染后的巨噬细胞受LPS活化后，上述指标均明显降低。(3) 在sRAGE作用下，受LPS活化的巨噬细胞RAGE表达（mRNA、蛋白水平），NF-κB活性，磷酸化激酶含量，炎症因子释放均受到明显抑制，sRAGE的抑制作用呈剂量依赖性。在sRAGE和Psilencer2.1-RAGE共同作用下，上述指标的抑制最为明显，与sRAGE组有显著差距。证实sRAGE对RAGE介导的巨噬细胞炎症反应有阻断作用，阻断作用具有剂量依赖性，其作用机制可能不仅局限于与RAGE受体竞争配体，还可能与其它受体竞争配体。(4) 在ERK激酶抑制剂PD98059作用下，ERK抑制组相较于阳性对照组，ERK激酶活性、NF-κB活性、炎症因子释放均有明显抑制，证实LPS-RAGE可能通过ERK- NF-κB途径激活巨噬细胞内炎症反应。（5）成功构建盲肠结扎穿孔方法导致严重腹腔感染、脓毒症大鼠动物模型，颈动脉注射Psilencer2.1-RAGE可以提高大鼠术后的7d生存率，减轻组织病理学损伤，这与大鼠体内炎症因子含量、NF-κB活性等降低相关。本研究阐明了配体-RAGE轴介导的信号通路对炎症反应的影响机制，并深入探讨其可能的功能调控方式为临床严重腹腔感染和脓毒症的治疗提供新的理论基础和实验依据。