SET核运输障碍及其在阿尔茨海默病中的作用及机理

核蛋白SET是内源性PP2A特异性抑制剂，在AD脑中高表达。胞浆PP2A活性下调在tau蛋白过度磷酸化和AD发病中起关键作用，但SET滞留于胞浆及其抑制PP2A的分子机制不明。申请者研究发现：切除核定位信号NLS使SET/NTF由核转位至胞浆；在大鼠脑内高表达SET/CTF引起tau过度磷酸化、神经元退变。在此基础上，本项目拟进一步1．应用基因定点突变SET内NLS序列中丝氨酸和赖氨酸，通过检测这些SET突变体在细胞内定位及其与核转运蛋白的相互作用，阐明NLS异常对SET核运输障碍的机制；2．应用pull-down等技术，探讨SET滞留胞浆与PP2A不同亚基的结合特性，阐明SET抑制PP2A的分子机制；3．采用基因转染、腺相关病毒投递系统在细胞和整体水平高表达全长SET，探讨SET在AD样tau蛋白异常磷酸化、聚积及学习记忆障碍中的作用。本项目研究结果将为AD的防治提供分子靶点和实验模型。

在基金的支持下，本项目全面完成任务计划书的内容：通过制备特异性抗体和免疫组化方法首次发现AD患者脑内核蛋白SET丝氨酸9位点发生磷酸化且在胞浆中大量聚积；应用基因定点突变SET和上调其上游激酶，明确丝氨酸9磷酸化修饰后SET与importin蛋白结合减少，从而影响其核输入过程；明确核蛋白SET磷酸化修饰显著降低PP2A活性并导致tau蛋白过度磷酸化；确定结构域序列6AKVSKK11为SET的核定位信号。结论：AD患者大脑皮质神经元SET丝氨酸Ser-9位点发生显著磷酸化，且在胞浆中发生聚集。SET丝氨酸Ser-9模拟持续磷酸化后与importin α，importin β的结合显著减少，从而导致SET核输入障碍。上调CKII能使SET丝氨酸Ser-9磷酸化程度增强，并且大部分转位并滞留于胞浆。SET丝氨酸Ser-9位磷酸化修饰后能与PP2Ac结合增强从而显著抑制PP2A活性，并导致tau蛋白发生过度磷酸化。6AKVSKK11是SET的核定位信号，其中赖氨酸Lysine 11是SET核定位信号上的功能氨基酸；并且可以通过NLS磷酸化修饰调节SET的核运输。本项目研究结果为AD的防治提供分子靶点和实验模型。部分主要结果已经发表在Neurobiology of Aging（见附件Yu G, Yan TH, Feng Y, Liu XH, Xia YY, Luo HB, Wang JZ, Wang XC*. Ser9 phosphorylation causes cytoplasmic detention of I2PP2A/SET in Alzheimer disease. Neurobiology of Aging. 2013 Jul;34(7):1748-1758）。