KCC2下调参与耳鸣发生的机制研究及新型TrkB拮抗剂的干预作用

Functional decline of cation-chloride cotransporter KCC2 on the surface membrane of mature cells would lead to high intracelluar chloride concentration and then reduce the inhibitory action of GABAergic system,which has been proposed to be closely related to tinnitus induction.Our preliminary data have demonstrated that down-regulation of KCC2 expression in the cochlea is a tinnitus-specific alteration following acoustic trauma.A novel TrkB antagonist L-Blocking Peptide(BP) is able to reverse the decline of KCC2 function induced by BDNF in vitro and could inhibit tinnitus induced by acoustic trauma in vivo as well.This study,therefore,aim to observe the activation status of BDNF/TrkB signaling in the periphery and central auditory system pre and post tinnitus inducing acoustic trauma with or without BP treatment.The functional change of KCC2 would also be detected under various conditions. Hopefully we would address the role of KCC2 and BDNF/TrkB signaling during the process of tinnitus induction,clarify the optimal means of BP intervention and provide a novel strategy for tinnitus prevention and therapy.

成年动物细胞膜钾氯共转运体KCC2功能下降会导致细胞内氯离子浓度升高，进而减弱GABA能系统的抑制功能，而后者已被证实与耳鸣的发生密切相关。我们前期研究已证实KCC2在耳鸣动物外周听觉系统表达特异性下调，新型TrkB拮抗剂L-Blocking Peptide(BP)在体外能逆转其配体BDNF诱导的细胞KCC2功能下降，而在动物体内能抑制噪声致耳鸣的发生。本项目拟应用动物行为学、听觉电生理学、形态学、分子生物学等方法检测致耳鸣噪声暴露前后以及不同方案BP干预后耳鸣动物和无耳鸣动物外周和中枢听觉系统KCC2功能的改变以及BDNF/TrkB信号通路的活化状态，阐明BDNF/TrkB信号活化诱导的KCC2下调在耳鸣发生机制中的作用，明确BP有效干预的最佳方案和有效窗口期，为耳鸣的预防和治疗提供新思路和新策略。

成年动物细胞膜钾氯共转运体KCC2功能下降会导致细胞内氯离子浓度升高，进而减弱GABA能系统的抑制功能，而后者已被证实与耳鸣的发生密切相关。本研究首先发现KCC2大量表达于内毛细胞、听神经传入纤维及螺旋神经节细胞。而在强噪声暴露后，耳蜗KCC2的表达明显下降。利用大鼠行为学模型，我们发现耳蜗KCC2表达的下调只发生在有耳鸣行为的大鼠。而没有耳鸣行为的大鼠，即使同时伴有听力损失，其耳蜗KCC2的表达也保持正常水平。这一发现揭示了耳蜗KCC2的改变为耳鸣特异性，而非听力损失特异性，也进一步提示了KCC2在耳鸣发生中的重要作用。我们在体外实验中检测了一种新型的TrkB拮抗剂L-Blocking Peptide(BP)对离体背根神经节细胞GABA逆转电位(GABA reversal potential, EGABA)的改变。结果显示BP能够逆转BDNF诱导的EGABA的去极化改变，提示BP通过阻断BDNF/TrkB信号激活，保护其下游效应分子KCC2的功能，从而维持GABA正常的抑制效应。随后我们通过圆窗膜导入BP，观察噪声暴露后动物耳鸣行为的改变。结果发现：在致耳鸣噪声暴露后，BP组大鼠的耳鸣行为比人工外淋巴液(对照)组大鼠的耳鸣行为明显减少。形态学研究发现BP可以保护毛细胞带状突触。分子生物学研究发现BP可以明显下调因噪声导致的BDNF水平升高。这些结果有力地证明了BDNF/TrkB信号通路参与耳鸣的发生，阻断该信号激活可以有效抑制耳鸣发生。此外，低、中、高浓度的BP不仅均能降低动物的耳鸣行为，而且可以减轻听力损失。我们跟踪耳鸣最新研究动态，发现SIRT1可以通过下游转录因子调节BDNF的表达，参与突触可塑性调节与记忆。于是我们增加了SIRT1在耳鸣发病机制中的研究。我们初步发现在老年性聋伴耳鸣的动物中，SIRT1在耳蜗及听皮层的表达明显下降，可能通过调节BDNF参与耳鸣的发生。此外，我们发现耳鸣患者血浆BDNF水平较对照者提高，但不同程度耳鸣患者的BDNF水平无明显差异。而TRT治疗可以明显改善大部分耳鸣患者的症状，并且这些患者的外周血BDNF水平也随之下降。这一结果提示BDNF可能成为耳鸣的生物学标志物。总之，我们结果提示BDNF参与耳鸣的发生，阻断BDNF/TrkB信号通路可以有效抑制耳鸣发生。