多发性硬化症NK细胞对自身T淋巴细胞的细胞毒性作用及其分子机制

NK细胞在多发性硬化症等自身免疫性疾病的发病机制中发挥重要作用，尤其是它可以抑制自身T淋巴细胞从而对这类疾病具有免疫保护作用。因此，研究NK细胞对自身T淋巴细胞的杀伤机制具有重要的理论和实际意义。本研究拟在建立以流式细胞仪检测细胞杀伤实验方法的基础上，明确NK细胞对自身T淋巴细胞杀伤伤用，并获得最优化的杀伤条件；利用各种阻断剂对NK细胞杀伤自身T淋巴细胞的杀伤用进行阻断实验，阐明NK细胞杀伤自身T淋巴细胞可能的机制；在已确定颗粒释放方式介导的细胞毒性作用是NK杀伤自身T淋巴细胞的主要途径的基础上，利用细胞内染色及RNA干扰技术检测哪一种颗粒酶（颗粒酶A，B或K）在NK杀伤自身T淋巴细胞的过程中发挥主要作用，以期获得NK细胞杀伤自身T淋巴细胞的分子机制，为进一步阐明NK细胞在多发性硬化症等自身免疫性疾病中的发病机制及建立以NK细胞为基础进行多发性硬化症等自身免疫性疾病的免疫治疗奠定基础。

NK在多发性硬化症等自身免疫性疾病中发挥着得要的免疫调节作用。为了阐明NK细胞对自身T淋巴细胞的杀伤作用及其可能的机制，我们开展了本研究，研究结果如下：.1. 明确了NK细胞对自身T淋巴细胞具有抑制或杀伤作用。应用BrdU掺入法及CFSE染色检测了PBMC中NK细胞对自身T淋巴细胞增殖的影响，结果显示NK细胞对T淋巴细胞的增殖具有抑制作用；利用分离的NK细胞及T淋巴细胞并进行了杀伤试验并进行了杀伤条件的优化，结果表明NK细胞对自身T淋巴细胞具有杀伤作用，随着杀伤时间的延长，杀伤率越高，且NK细胞只杀伤激活的T淋巴细胞胞，而对未激活的T淋巴细胞没有杀伤能力。.2. 明确了NK细胞是以颗粒释放方式杀伤自身T淋巴细胞。根据NK细胞杀伤靶细胞两种作用机制的特点，我们选择不同的阻断剂，利用建立的流式细胞仪检测细胞杀伤作用的实验方法，研究不同阻断剂对NK细胞杀伤自身T淋巴细胞的阻断效果。结果表明，NK细胞主要通过颗粒释放的方式杀伤自身T淋巴细胞。.3. 明确了颗粒酶K在NK杀伤自身T淋巴细胞中的发挥主要作用。利用荧光标记的抗人颗粒酶A，B或K的抗体对共培养的NK细胞和T淋巴细胞进行细胞内染色，通过流式细胞仪检测T淋巴细胞中颗粒酶的水平，结果表明，更多的颗粒酶K从NK细胞释放到T淋巴细胞中，而颗粒酶A和颗粒酶B转移的比较少；根据颗酶A，B或K的不同作用机制，利用流式细胞仪检测Caspase-3的激活及线粒体中ROS的产生和线粒体电势下降的情况，结果显示T淋巴细胞中的Caspase-3并没有明显被激活，但ROS的产生增加和线粒体膜电位下降，表明颗粒酶B没有发挥主要作用；进一步利用RNA干扰实验最终确定颗粒酶K在NK细胞杀伤自身T淋巴细胞中发挥主要作用。.4. 明确了EAE小鼠的NK细胞对自身T淋巴细胞的杀伤能力要低于正常小鼠的NK细胞。利用MOG35-55免疫小鼠制备EAE小鼠模型，分离EAE小鼠和正常小鼠的NK细胞和T淋巴细胞并进行共培养，从杀伤率、ROS产生及颗粒酶转移实验均表明EAE小鼠NK细胞对自身T淋巴细胞的杀伤能力显著低于正常小鼠的NK细胞。该研究结果进一步从EAE疾病模型动物证明了NK细胞对自身T淋巴细胞的杀伤作用及其机制。