甜菜M14品系半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的功能研究

植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂（cystatin）在提高植物对各种病虫害抗性以及缓解非生物胁迫损伤等方面有重要应用价值。目前，利用植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因提高植物对非生物胁迫抗性的报道较少，对其相关机制也没有研究。.本项目实验材料为含有野生白花甜菜优质基因资源的甜菜单体附加系M14品系，以前期对转录组和蛋白质组研究获得的EST和蛋白质信息为基础，利用RACE技术获得特异表达的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因（BvM14-cystatin）的cDNA全长；在转录和蛋白质水平分析甜菜M14品系各组织在各种非生物胁迫下该基因的表达情况；使BvM14-cystatin 在拟南芥中过量表达，对其提高植物对非生物胁迫的抗性进行鉴定；通过测定转基因拟南芥体内半胱氨酸蛋白酶活力和分析抗氧化相关基因的表达情况，对M14品系半胱氨酸蛋白酶抑制剂提高植物对非生物胁迫抗性的机制进行探讨。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂（cysteine protease inhibitors, cystatin）是生物体内一类与半胱氨酸蛋白酶特异性结合，从而抑制半胱氨酸蛋白酶活性的蛋白质，广泛参与植物在非生物胁迫条件下的应答，并能提高植物的抗逆性。在项目开展过程中，课题组以甜菜M14品系为试验材料，克隆并获得了半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因（BvM14-cystatin）。研究显示该基因编码的蛋白质具有典型的植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因家族保守的功能结构域；该基因在甜菜M14品系中根、茎、叶、花组织中广泛表达，并参与盐胁迫下的应答反应。课题组构建了该基因的原核表达体系，在通过镍离子亲和层析获得纯化蛋白后开展了酶活力测定试验，结果显示BvM14-cystatin蛋白能够显著抑制木瓜蛋白酶活力。与此同时，本项目还构建了植物表达载体pBI-BvM14-cystatin并在拟南芥中过量表达，抗性试验结果表明BvM14-cystatin基因能够显著提高拟南芥对高盐及干旱胁迫的抗性能力。在圆满完成本项目研究内容的同时，课题组为进一步挖掘甜菜M14品系的优质基因资源，开展了不同盐浓度胁迫下甜菜M14品系定量蛋白质组学（DIGE、iTRAQ）及转录组学（SSH、RNA-seq）研究，探讨了甜菜M14品系抗盐机制。